Орз инкубационный период: ОРЗ — симптомы, причины и профилактика

Содержание

болеть или не болеть?, Клиника Пасман

Самый распространённый диагноз, который ставят врачи пациентам – ОРВИ (острая респираторная вирусная инфекция). Но инфекция инфекции рознь: кто-то, испытав лишь лёгкое недомогание, уже через несколько дней готов вернуться к привычному ритму жизни, а кто-то на пару недель вылетает из обоймы. Дело в том, что под термин ОРВИ попадает более двух сотен болезней, возбудителями которых являются вирусы, поражающие преимущественно слизистые оболочки верхних дыхательных путей… Уберечься от риновирусов, аденовирусов и ротавирусов, парагриппа и гриппа и сопутствующих им бактериальных осложнений можно. Как – в преддверии эпидемиологически потенциального сезона рассказывает врач «Клиники Пасман», терапевт первой категории Елена Михайловна Параева.

Симптоматика

Острая респираторная вирусная инфекция (ОРВИ) – распространённый диагноз и крупная группа инфекционных заболеваний.

ОРВИ вызывается разнообразными возбудителями, среди которых насчитывают несколько групп вирусов (аденовирусы, риновирусы, ротавирусы, реовирусы, вирусы парагриппа, гриппа и др.) и сотни их подтипов. В настоящее время установлена вирусная природа практически всех так называемых простудных заболеваний.

У каждой вирусной инфекции – специфическая клиническая картина. Грипп характеризуется острым началом, высокой температурой, возможностью развития тяжёлых форм болезни. Парагрипп протекает легче гриппа: менее выражены токсические явления, в клинической картине преобладает кашель. Риновирусная инфекция – это сильный насморк, слезотечение. Аденовирусы – боли в горле, ангина, поражение конъюнктивы глаз, лимфатических узлов. Группа ротавирусных инфекций (их еще называют кишечным гриппом) к температуре и простудным явлениям добавит боли в животе, диарею, рвоту.

Распознать коварный респираторный вирус несложно. По утверждению врача, существует два основных синдрома ОРВИ.

Первый – синдром поражения верхних дыхательных путей: насморк, чихание, слезотечение, боль в горле, осиплость голоса, сухой кашель.

Второй – синдром общей интоксикации, к нему относится комплекс таких симптомов, как высокая температура, головная боль, озноб, боли в мышцах, ломота, общее плохое самочувствие.

При часто встречающихся респираторных вирусных инфекциях более выражен первый синдром. Если же вы отмечаете у себя и второй комплекс симптомов то, скорее всего, вас поразил грипп.

На вопрос о том, почему медики отдельно дифференцируют грипп, но не диагностируют прочие ОРВИ как самостоятельные отдельные заболевания (а их более 200), Елена Михайловна Параева отвечает: «Массовая верификация респираторных вирусных заболеваний в России не проводится. Исключение – клинические исследования и научные изыскания. Лабораторная вирусологическая диагностика также начинается в случае тяжёлых эпидемий – тогда учёные исследуют вирусы, типирование возбудителя, определяют антигенный состав.

А так ОРВИ – это заболевания, которые предсказуемо протекают, лечение – преимущественно симптоматическое. Нам достаточно понять, какая группа вирусов активна. А верификации конкретного вируса для назначения лечения не требуется.

Грипп – это тоже ОРВИ, но протекает он тяжелее и дольше прочих инфекций. Беда в том, что грипп опасен не только сам по себе: врачи боятся также его осложнений (бактериальные синуситы, отиты, трахеиты, бронхиты, пневмония, менингит, энцефалит, миокардит и т.д.). Именно поэтому врачи особо выделяют грипп из ряда респираторных заболеваний».

Заболеваемость

Специалисты отмечают сезонность заболеваемости и связывают её с природными особенностями вирусной циркуляции. Как правило, отмечают они, в холодное время года циркулирует большее количество вирусов. В 2015 году пик заболеваемости, по прогнозам, придётся на период с января по начало марта.

Влияет на заболеваемость и образ жизни человека: зимой люди больше времени находятся в помещениях, возникает скученность и увеличивается количество контактов. Пасть жертвой ОРВИ, к сожалению, несложно. Вирусы данной категории весьма заразны, поскольку передаются воздушно-капельным путём. Более того, есть данные, что вирусы ОРВИ способны распространяться при телесном контакте (например, при рукопожатии, поцелуе, объятии).

Инкубационный период достаточно краток: от нескольких часов до 7 суток, как при гриппе, так и при прочих респираторных заболеваниях, чаще всего 3-4 дня (причём существуют инфекции, которые действуют буквально через пару часов, например, риновирусные инфекции, то есть банальный насморк). Заболеет ли здоровый человек после контакта с больным и как скоро, зависит от сопротивляемости организма и состояния собственного иммунитета.

Кстати, популярный миф о том, что в морозы вирусы погибают (особенно часто это заблуждение касается гриппа), научно не обоснован. Елена Михайловна Параева связывает его опять же с вынужденным образом жизни: «В сильные морозы люди сидят по домам, исключая тем самым контакты с внешним миром.

Заразиться ОРВИ таким образом – проблематично».

Вакцинация

Высокая восприимчивость к ОРВИ и, в частности, к гриппу вынуждает медицину искать способы борьбы с болезнью. Наиболее оптимальный путь – предотвратить заболевание.

Разработка вакцины от гриппа – непрекращающаяся работа. Считается, что резервуар для вирусов гриппа – птицы. В организме пернатых вирус постоянно мутирует, приспосабливаясь к существующим условиям и конфликтуя с вырабатываемым иммунитетом. Затем мутировавший вирус передаётся в человеческую популяцию и распространяется по планете.

Каждый год учёные изучают типологию актуальных вирусов гриппа, делая прогнозы их циркуляции на ближайшее будущее. Конечно, предсказать ситуацию сложно, ведь распространение гриппа зависит от нескольких факторов – и температуры за окном, и патогенности вируса. Но исследования позволяют точно сформировать состав вакцины, которая будет использоваться в текущем году.

Елена Михайловна Параева признаёт, что если бы вирус гриппа не мутировал постоянно, жизнь была бы проще, ведь ответом на вакцинацию от гриппа является стойкий пожизненный иммунитет! Вот только вирусы, от которых мы защитились в прошлом году, в нынешнем уже не актуальны.

Тем не менее популяризация ежегодной вакцинации от гриппа значительно улучшила эпидемиологическую обстановку в мире.

По графику иммунизация населения начинается в осенний период – с конца сентября. В обязательном порядке прививаются социально активные слои населения: школьники, студенты, работники социальной сферы – врачи, учителя и т.д. Но медики настоятельно советуют поставить прививку каждому. Это совершенно безопасно: современная вакцина является расщеплённой, то есть содержит не вирусы, а их компоненты. Именно поэтому человек, в организм которого введена вакцина, не способен заболеть гриппом вследствие вакцинации. Стойкий иммунитет формируется через две недели после постановки прививки. Сейчас еще можно пройти вакцинацию и подготовиться к сезону гриппа!

Врач «Клиники Пасман» предупреждает: после вакцинации на протяжении 10-14 дней происходит кратковременное угнетение иммунитета – пока идет формирование защитных реакций. Поэтому в это время стоит поберечься, избегая контакта с больными людьми.

Вакцина от гриппа гарантирует, что вы либо совершенно избежите гриппа в этом году, либо – в случае высокой вирусной патогенности – перенесете заболевание в максимально лёгкой форме и без осложнений, которыми грипп и опасен.

К сожалению, вакцина от гриппа не является панацеей и не убережёт вас от прочих респираторных вирусных инфекций. В настоящее время учёными разрабатывается несколько вакцин – от парагриппа и других ОРВИ, но пока они не введены в клиническую практику.

Лечение

В среднем на протяжении года взрослый переносит ОРВИ 2-3 раза. Дети болеют чаще, даже до 10 раз в год – это связывают с отсутствием специфического иммунитета и посещением детских учреждений. Но не стремитесь изолировать ребёнка, врачи настаивают на том, чтобы дать детям возможность встретиться с болезнью. Именно так организм тренируется, формирует иммунный ответ и учится в будущем противостоять вирусам – ведь избежать их, живя в современном мире, невозможно. Задача в том, чтобы максимально облегчить течение болезни – как у ребёнка, так и у взрослого, а это способен сделать лишь врач.

При нетяжелом течении не назначается специфическое противовирусное лечение (которое, кстати, у вирусов достаточно быстро развивает устойчивость). Лечение в этом случае симптоматическое, нацеленное на улучшение самочувствия. Врач посоветует препараты от насморка, кашля, боли в горле, жаропонижающее, обезболивающее – в зависимости от существующей клинической картины.

В иных случаях (особенно при гриппе) рекомендуют употреблять противовирусные препараты, повышающие устойчивость организма к вирусам или вызывающие в организме выработку антител, борющихся с вирусом.

В обязательном порядке врач посоветует обильное питьё; общеукрепляющие средства, среди которых натуральные растительные препараты эхинацеи, женьшеня, китайского лимонника; поливитамины.

Период нетрудоспособности при ОРВИ составляет 5-7 дней, при гриппе чуть дольше – 7-8 дней.

Елена Михайловна Параева предупреждает: никакого самолечения и самостоятельного приёма антибиотиков! Дело в том, что антибиотики не действуют на вирусы, угнетая иммунитет и снижая иммунную защиту организма. Принимая антибиотик, мы лишь формируем в организме устойчивую к его действию микрофлору, и в следующий раз препарат не подействует.

Контроль врача при ОРВИ особенно важен, поскольку банальная вирусная инфекция может привести к тяжелым осложнениям, требующим специфического лечения (как раз антибиотиками) и особой реабилитации.

Так что если вы всё же решили пересидеть простуду за выходные с чашкой горячего чая и банкой малинового варенья, не теряйте бдительности и срочно обращайтесь к врачу, если вдруг обнаружили у себя нетипичные для ОРВИ симптомы: высокая температура, которую невозможно сбить приёмом жаропонижающих препаратов; одышка, боли в груди, сильный кашель, примесь крови в мокроте, гнойные отделения из полости носа, боль в ухе, сильная головная боль, сыпь на теле и т.д. Помните, существуют заболевания, первые проявления которых мимикрируют под вирусные инфекции – это и опасная менингококковая инфекция, и вирусный гепатит, и даже ВИЧ-инфекция.

Также нередки случаи, когда после перенесения вирусной инфекции кратковременно ухудшается иммунитет и человек заболевает повторно. Разорвать порочный круг поможет квалифицированный терапевт, разработав для пациента индивидуальную систему лечения, реабилитации и дав советы по ежегодной профилактике.

Вполне вероятно, что терапевт направит вас к иммунологу, так как существуют заболевания, вызывающие снижение иммунной активности организма. Иммунограмма определит, в чём причина частых болезней, и даст возможность точно корригировать бреши в иммунитете.

Пациенту, желающему пережить период болезни с максимальным комфортом, «Клиника Пасман» предлагает удобную систему записи на приём: попасть к врачу Клиники вы можете в любое удобное для вас время.

Здесь нет очередей – это значит, что контакты с другими заболевшими полностью исключены.

Всё внимание врача в течение 40 минут приёма будет полностью отдано вам. Специалист подробно расспросит о симптомах, проведёт осмотр, соберёт анамнез, при необходимости назначит анализы и определит тактику лечения.

В «Клинике Пасман» действует принцип тесного междисциплинарного сотрудничества: это значит, что врачи любых специализаций постоянно находятся в контакте между собой. Коллегиальный осмотр сложного пациента поможет наиболее точно поставить диагноз и назначить лечение.

Всегда возможен вызов врача на дом (что особенно актуально при сильном жаре, плохом самочувствии или болезни ребёнка).

Лечение под контролем врача снизит риск осложнений и хронизации заболевания, позволит легче перенести симптомы и в короткие сроки вернуться к привычному ритму жизни.

Профилактика

Услышав вопрос о профилактике ОРВИ, Елена Михайловна Параева улыбается. Оказывается, все до смешного просто: нужно вести здоровый образ жизни и стараться быть всегда в хорошем настроении. Доказано, что люди, подверженные депрессиям, болеют респираторными вирусными инфекциями в разы чаще. Так что совет прост: улыбайтесь! Защититься от ОРВИ и гриппа, повысив иммунитет, также помогут несколько советов.

Хорошо питайтесь, организуйте сбалансированный рацион.

Соблюдайте здоровый режим дня, высыпайтесь.

Не нервничайте, избегайте стрессов, в том числе и на работе.

Избавьтесь не только от эмоциональных, но и от физических перегрузок, не переутомляйтесь. Тем не менее, занимайтесь физкультурой, спортом, регулярно делайте зарядку.

Чаще гуляйте на свежем воздухе.

Регулярно проветривайте помещение.

Принимайте поливитамины.

Старайтесь избегать контактов с больными вирусной инфекцией. В период эпидемий специалист «Клиники Пасман» рекомендует принимать препараты, повышающие иммунную защиту (уточняйте названия препаратов у своего врача).

И будьте здоровы!

Профилактика и лечение гриппа, ОРВИ, ОРИ, ОРЗ

Осенне-зимние и зимне-весенние периоды — пик заболеваемости вирусными респираторными заболеваниями. Именно в эти периоды человек более восприимчив к вирусам не только гриппа, но и других респираторных инфекций, которые передаются воздушно-капельным путем.

Грипп, ОРВИ (острые респираторно-вирусные инфекции), ОРИ (острые респираторные инфекции), ОРЗ (острые респираторные заболевания) – это группа болезней, возбудителями которых являются вирусы. Эти заболевания передаются среди людей воздушно-капельным путем и поражают преимущественно верхние дыхательные пути.

Возбудителями каждого заболевания данной группы являются вирусы. Источником инфицирования служит человек, болеющий данным заболеванием. Как правило, наиболее заразен он в первые несколько дней болезни. Заражение инфекцией происходит воздушно капельным путем. Во время разговора, чихания, кашля вирусы от больного человека попадают в воздух с капельками слюны и слизи. При вдыхании такого воздуха вирусы попадают в верхние дыхательные пути здорового человека, размножаются и вызывают болезнь.

Заболевание протекает остро, зачастую в виде вспышек в холодное время года. Для гриппа характерно возникновение эпидемий, внезапно начинающихся и распространяющихся довольно быстро. Нередко к вирусной инфекции присоединяется бактериальная инфекция и болезнь осложняется бронхитом или пневмонией. Инкубационный период составляет от нескольких часов до нескольких дней.

Симптомами этой группы заболеваний являются: повышение температуры тела, озноб, ломота в теле, мышечная слабость и боли в мышцах, чихание, затруднение носового дыхания, заложенность носа и насморк, слабость, недомогание, быстрая утомляемость, снижение работоспособности, ощущение тяжести в голове и головные боли, потливость, кашель сухой и влажный, першение и боли в горле, боли в горле во время глотания, охриплость и осиплость голоса.

Для гриппа характерна более яркая клиника с выраженным проявлением всех симптомов, плюс высоким уровнем температуры тела, слезотечением, светобоязнью, ломотой в теле, ознобами.

Парагрипп протекает несколько мягче. Риновирусная инфекция поражает преимущественно слизистую оболочку носа и носоглотки, что проявляется выраженным насморком. Аденовирусная инфекция поражает кроме верхних дыхательных путей глаза и лимфатические узлы, что проявляется появлением белых налетов в виде пленок и нитей на небных миндалинах, двусторонних пленчатых конъюнктивитов, отека век, увеличением лимфоузлов, возникновением кожной крупнопятнистой сыпи.

Диагностика гриппа, ОРВИ, ОРИ, ОРЗ основывается на клинической картине заболевания, эпидемиологической обстановке. Также производится общий анализ крови, выполняется рентген-флюорографическое исследование органов грудной клетки. В отдельных случаях занимаются выявлением вируса.

Профилактика и лечение гриппа, ОРВИ, ОРИ, ОРЗ

Для предотвращения заражения окружающих людей человек, заболевший ОРВИ, должен быть изолирован в отдельную комнату. У него должна быть отдельная посуда и предметы личной гигиены. Лечение симптоматическое и патогенетическое. Оно состоит в применении нестероидных противовоспалительных средств, противовирусных/противогриппозных препаратов, сосудосуживающих капель, спреев для орошения слизистой ротоглотки, полоскании горла растворами антисептиков, витаминотерапии. Важно на протяжении всего периода повышения температуры тела соблюдать постельный режим, обильно пить теплые жидкости.

В качестве профилактики используется вакцинация против гриппа живыми и инактивированными вакцинами.

Источник информации:

Похожие материалы на сайте:

ОРВИ – МОСИТАЛМЕД

ОРВИ (острая респираторная вирусная инфекция) — группа заболеваний, при которых происходит поражение эпителия респираторного тракта вирусами. Наиболее часто к ОРВИ приводит размножение вирусов гриппа, парагриппа и аденовирусов. Передача возбудителя происходит воздушно-капельным путем, с чем связана высокая контагиозность заболевания.

В клинике «Моситладмед» проводится полная диагностика острых респираторных заболеваний, которая дает возможность определить возбудителя и провести этиотропное лечение.

Причины ОРВИ

Основной причиной заболевания является проникновение вирусной инфекции. Заражение происходит чаще всего аэрозольным, реже контактным и бытовым путем. Когда появляются первые симптомы ОРВИ, больной становится носителем инфекции и способен передавать её окружающим.

Предрасполагает к развитию ОРВИ переохлаждение, гиповитаминоз, снижение иммунитета и нахождение в закрытых помещениях с большим скоплением людей.

Симптомы ОРВИ

Симптомы ОРВИ могут появляться не сразу после заражения, обычно клиника начинается со 2-7 дня болезни. В инкубационный период заболевания клинические проявления могут отсутствовать, а может быть незначительное повышение температуры, першение горла и насморк.

Первыми признаками респираторной вирусной инфекции является острое начало с повышения температуры до 37,5-38°С, появления признаков интоксикации и катаральных явлений. К первым относят:

Лихорадку;
Озноб;
Суставные, мышечные и головные боли,
Тошноту, снижение аппетита;
Ломоту в суставах;
Потливость;
Нарушение сна;
Общую слабость.

Катаральные явления ОРВИ включают:

Покраснение глаз;
Слезотечение;
Обильные слизистые выделения из носа;
Отечность и белый налет на миндалинах;
Першение и боль в горле;
Кашель со слизистой мокротой.

Сколько держится ОРВИ зависит от возбудителя. Обычно заболевание длится не более двух недель, более длительное течение приводит к развитию осложнений и появлению рецидивов. Осложнением острой респираторной инфекции является отит, гайморит, фронтит, а также инфекции мочеполового тракта.

Диагностика ОРВИ

Для диагностики острой респираторной вирусной инфекции врач сначала собирает анамнез и жалобы пациента. Высоко информативен при том эпидемиологический анамнез пациента, уточнение возможного контакта с инфицированным. В клинике МОСИТАЛМЕД проводится диагностика возбудителя при помощи таких современных исследований, как РИФ, ПЦР, РСК и РТГА. Если после ОРВИ имеются осложнения, то может потребоваться рентген диагностика придаточных пазух носа и органов грудной полости.

Лечение ОРВИ

Лечение ОРВИ в клинике МОСИТАЛМЕД проводится путем применения противовирусных, жаропонижающих, отхаркивающих и противовоспалительных препаратов. На консультации наш специалист индивидуально подберет дозу препарата с учетом особенностей организма, а также составит комплексную схему терапии ОРВИ. Местно при выраженных проявлениях ринита применяют носовые капли и мази с противовоспалительным, противоотечным и сосудосуживающим действием.

Для улучшения общего самочувствия и ускорения выздоровления рекомендуется диета, богатая белковой пищей, витаминотерапия и ингаляции.

Профилактика ОРВИ

Профилактика ОРВИ бывает специфической и неспецифической. Первая осуществляется путем вакцинирования населения в период сезонных пандемий. Этот метод позволяет сформировать иммунитет к наиболее распространенным штаммам возбудителя.

Неспецифическая профилактика включает рациональное питание, регулярные прогулки на свежем воздухе, физические упражнения и употребление свежих фруктов и овощей.

Получить консультацию и записаться на прием можно по телефону: +7 (495) 212-90-98

симптомы, признаки и отличия ОРЗ от ОРВИ

Многие относятся к простуде, как к чему-то несерьезному. Кто-то пытается перенести болезнь на ногах, считая, что пара таблеток — и все скоро пройдет, а сейчас есть дела поважнее. На самом же деле несвоевременное, неправильное или недоведенное до конца лечение может обернуться последствиями похуже, чем заложенный нос или больное горло. Игнорируемая болезнь может плавно перетечь в синусит, фарингит, трахеит или даже пневмонию, лечить которые сложнее и неприятнее, не говоря уже о том, что воспаление легких — крайне опасное осложнение. А недолеченный недуг может перейти в хроническую форму и остаться с пациентом на всю жизнь.

Прежде чем поговорить об особенностях протекания заболеваний верхних дыхательных путей и их лечения, разберемся в том, почему существует два разных диагноза — «ОРЗ» и «ОРВИ» — и чем они друг от друга отличаются.

ОРВИ и ОРЗ: есть ли разница в диагнозах

Чаще всего люди путают такие понятия, как ОРЗ и ОРВИ. Врачи ставят то один, то другой диагноз, а от чего это зависит остается непонятным, ведь симптомы, по сути, одинаковы. Так в чем же разница между ОРЗ и ОРВИ?

Диагноз «острое респираторное заболевание» врач ставит в том случае, если не может точно определить тип инфекции. Это более общее название, включающее в себя как ОРВИ (острую респираторную вирусную инфекцию), так и другие простудные заболевания, вызванные бактериями или грибками. Обычно симптоматика в этом случае менее выражена, что не дает сделать конкретные выводы. Для уточнения диагноза чаще всего достаточно общего анализа крови — тогда уже можно скорректировать лечение, исходя из типа инфекции.

Почему необходимо знать, в чем отличие ОРЗ от ОРВИ? Чтобы понимать, как можно лечиться в том или ином случае, а как нельзя. Например, возможна следующая ситуация: пациенту поставили диагноз «ОРЗ», а он пошел в аптеку и купил себе антибиотики, решив, что это бактериальная инфекция. И почему-то ему не стало лучше, а даже наоборот — только хуже. Все потому, что на самом деле это был вирус, антибиотики в этом случае неэффективны. Более того, они подавляют иммунитет, играющий центральную роль в борьбе с ОРВИ.

На заметку
Возбудителями ОРВИ могут быть вирусы гриппа, парагриппа, риновирусы, аденовирусы, коронавирусы и другие — всего более 200 разновидностей[1].

Первые признаки и стадии развития острых респираторных заболеваний

Любое острое респираторное заболевание начинается с того, что в организм проникает патоген. Он начинает адаптироваться к условиям в нашем теле, размножаться и пытаться распространить себя по другим клеткам и тканям. При этом симптомы заболевания в этот момент еще не проявляются — сперва идет инкубационный период.

Инкубационный период — это промежуток времени между попаданием инфекции в организм и появлением первых признаков заболевания. Иначе говоря, «скрытый» период. Может длиться от нескольких часов до пары недель в зависимости от типа и численности возбудителя, места его «внедрения» и состояния иммунной системы человека. Стоит отличать инкубационный период от латентного: второй завершается не при первых симптомах, а когда человек становится заразным, что часто происходит раньше (при гриппе, например, латентный период обычно заканчивается за день до того, как проходит инкубационный).

На этом этапе запускаются первые защитные механизмы. Бывает так, что первичного иммунного ответа достаточно, чтобы справиться с патогеном, и болезнь в конечном итоге не развивается. Если этого не происходит, то инкубационный период сменяется продромальным или, минуя его, периодом клинических проявлений.

В продромальный период (если он все же наступает, чего часто не происходит, например, при гриппе) начинают проявляться первые, слабо выраженные (неспецифические) симптомы ОРЗ и ОРВИ: легкое недомогание, небольшое повышение температуры, мышечная и головная боль, снижение аппетита, беспокойный сон и другие. Уже на этом этапе в анализах можно наблюдать изменения, позволяющие поставить пациенту диагноз и начать лечение (а в этом деле чем раньше начнешь терапию, тем быстрее выздоровеешь). Но, как правило, многие откладывают обращение к врачу, надеясь, что ухудшение не наступит. И так иногда происходит: аналогично инкубационному периоду иммунная система может завершить борьбу в продромальном. Но чаще данный этап развития болезни перетекает в период клинических проявлений.

Период клинических проявлений (разгара болезни) — тот самый момент, когда мы явственно чувствуем, что заболели. Температура повышается, общее недомогание усиливается, развивается воспалительный процесс в носоглотке и/или ротоглотке. В этот же период носитель инфекции становится наиболее опасным для окружающих, выделяя большое количество патогена. На этом этапе игнорировать болезнь уже становится невозможно: если сразу не приступить к лечению, осложнения не заставят себя долго ждать. При ответственном подходе и своевременно принятых мерах вслед за разгаром болезни наступает выздоровление.

В период выздоровления (реконвалесценция) пациент начинает чувствовать себя лучше, симптомы исчезают, функционирование пораженных органов восстанавливается. Опасность этого периода в том, что многие не доводят процесс выздоровления до конца, решив, что улучшения состояния уже достаточно, чтобы прекратить лечение. Подобное решение может привести как к обострению (повторному развитию симптомов), так и к хронической форме заболевания. Поэтому необходимо четко следовать рекомендациям врача, пропивать полный курс назначенных препаратов и внимательно следить за своим самочувствием.

Что можно предпринять при появлении симптомов ОРЗ и ОРВИ

Как уже говорилось, чем раньше начать лечение — тем лучше. Рекомендуется принимать меры в первые 72 часа с момента появления первых симптомов, не забывая, конечно, предварительно проконсультироваться с врачом.

Основное, что стоит сделать при появлении признаков болезни — остаться дома и отдыхать. Во-первых, отсутствие дополнительной нагрузки на организм сильно поможет иммунитету, во-вторых, вы не будете заражать других людей. Также стоит учитывать, что больной организм уязвимее, а значит, помимо текущей инфекции, можно дополнительно «подхватить» другую.

Кроме того, важно пить много жидкости (простой воды, можно чередовать с чаем), почаще проветривать помещение и питаться богатой витаминами и минералами пищей.

Препараты, назначаемые при лечении таких заболеваний, как ОРЗ и ОРВИ, можно поделить на три группы.

Симптоматические — облегчающие состояние больного. К ним относятся жаропонижающие, болеутоляющие, антигистаминные, сосудосуживающие, средства от кашля и другие.
Иммуностимуляторы — препараты, задача которых — дать иммунитету дополнительную поддержку. В основном такие средства повышают функцию тех или иных иммунных клеток, действуя на конкретный этап в иммунном ответе. Их можно применять не только для лечения уже развившегося заболевания, но и для профилактики.
Противовирусные — препараты, применяемые в случае, если пациент инфицирован вирусом. Усиливают те звенья иммунной системы, которые наиболее эффективны против данного типа инфекции и, как правило, замедляют размножение вируса.
Антибиотики (противомикробные препараты) — применяются против бактериальной инфекции и бесполезны против вирусов и ряда других патогенов. Такие лекарства либо подавляют размножение бактерий, либо уничтожают их.

Как видно, наиболее универсальными препаратами являются симптоматические и иммуностимуляторы — их выписывают при любом типе инфекции, а вторые подходят также для профилактики. Осторожнее всего следует быть с антибиотиками: это сильнодействующие средства, способные как помочь, так и нанести организму вред. И важно помнить: любые лекарства имеют свои противопоказания, перед применением необходимо посоветоваться с врачом.

Минздрав рекомендует рассматривать любой случай ОРВИ как подозрение на коронавирус

Медработникам следует рассматривать любой случай ОРВИ вне зависимости от анамнеза как возможную коронавирусную инфекцию. Об этом говорится во временных методических рекомендациях по диагностике и лечению вирусных заболеваний в условиях пандемии, опубликованных на сайте Минздрава в понедельник.

В пособии, в частности, говорится, как отличить коронавирус от других инфекций. Документ подготовила группа ведущих российских учёных и клиницистов. Авторы в рекомендациях приводят несколько вариантов схем лечения для пациентов с ОРВИ на амбулаторном этапе.

«В настоящее время наблюдается спад заболеваемости сезонными ОРВИ на фоне нарастания заболеваемости COVID-19. Принимая во внимание такие эпидемиологические особенности, любой случай ОРВИ вне зависимости от эпидемиологического анамнеза следует рассматривать как подозрительный на COVID-19», — указывается в документе.

Рекомендации призваны обеспечить врачей необходимой информацией, чтобы они безотлагательно начинали лечение пациентов с симптомами ОРВИ, не дожидаясь результатов теста на коронавирус. Указывается, что из-за высокого сходства клинических проявлений ОРВИ и коронавируса, а также возможности совместной формы заболевания, врачи могут применять комбинированные схемы лечения с помощью лекарств от этих инфекций.

Отмечается, что противовирусная терапия должна начинаться в первые 48 часов с начала заболевания. Доказано, что именно раннее начало лечения позволяет легче и быстрее перенести COVID-19.

«Медикаментозное этиотропное лечение при ОРВИ доказано только в отношении одного возбудителя — вируса гриппа. Кроме того, ВОЗ для лечения гриппа рекомендует применение этиотропных химиопрепаратов, блокирующих репликацию вируса, то есть обладающих прямым противовирусным действием», — говорится в документе.

Такой подход должен использоваться также и при назначении антибактериальной терапии при наличии показаний к ней.

Подчёркивается, что в амбулаторных условиях можно лечить пациентов с лёгким течением ОРВИ. Но следует помнить, что больные в возрасте старше 65 лет или имеющие хронические заболевания являются группой риска тяжёлого течения коронавирусной инфекции. Согласно рекомендациям, по решению врача вне зависимости от тяжести течения заболевания помощь таким пациентам может оказываться в условиях стационара.

Указывается, что инкубационный период большинства ОРВИ, как правило, не превышает трёх дней, тогда как длительность инкубационного периода COVID-19 может колебаться от одного до 14 дней, но в среднем составляет пять дней. При гриппе заболевание начинается остро, при коронавирусе и ОРВИ выраженность симптоматики, как правило, нарастает постепенно.

Как при коронавирусе, так и при гриппе может отмечаться высокая температура, кашель, лихорадка, слабость. При ОРВИ лихорадка и слабость встречаются редко. При этом при гриппе и ОРВИ затруднённое дыхание и одышка отмечаются значительно реже, чем при COVID-19.

Документ направлен в регионы для ознакомления всех врачей, которые лечат пациентов с признаками ОРВИ.

Ранее «Парламентская газета» сообщала, что Минздрав 9 апреля выпустил пятую версию методических рекомендаций по профилактике, диагностики и лечению коронавируса, в которые вошли наиболее актуальные методы борьбы с COVID-19, а также технологии защиты медперсонала.

В частности, ведомство расширило список лекарств для больных COVID-19. В него входят хлорохин, гидроксихлорохин, мефлохин, лопинавир + ритонавир, азитромицин (в комбинации с гидроксилорохином), препараты интерферонов, тоцилизумаб, надропарин кальция. Ещё три препарата — умифеновир, ремдесивир, фавипиравир — находятся на стадии клинических испытаний у пациентов с подтверждённым коронавирусом.

По последним данным, общее число инфицированных коронавирусом в России превысило 18 тысяч, зафиксировано 148 летальных исходов, вылечились 1470 человек.

Ранее в комментарии «Парламентской газете» академик РАН Михаил Кирпичников предположил, что эпидемия коронавируса в России достигнет пика в конце апреля-начале мая и затем выйдет на плато. Но как долго будет длиться это плато, зависит в том числе от соблюдения гражданами санитарно-эпидемиологических мер, установленных Правительством.

Защитись от гриппа! Сделай прививку!

Информационное письмо

Термин «острое респираторное заболевание» (ОРЗ) или «острая респираторная вирусная инфекция» (ОРВИ) охватывает большое количество заболеваний, во многом похожих друг на друга. Эти заболевания характеризуются одним и тем же набором симптомов, вызываются вирусами, проникающими в организм вместе с вдыхаемым воздухом через рот и носоглотку. Таких вирусов 130 видов (грипп, парагрипп, аденовирус, риновирус, реовирус и т.д.).

Основные симптомы: высокая температура, кашель (обычно сухой), головная боль, мышечная боль и боль в суставах, сильное недомогание (плохое самочувствие), боль в горле и насморк.

Сезонный грипп — это острая респираторная инфекция, вызываемая вирусами гриппа, которые циркулируют во всем мире. Существует 4 типа вирусов сезонного гриппа – типы A, B, C и D. Вирусы гриппа A и B циркулируют и вызывают сезонные эпидемии болезни. Болезнь может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме и даже заканчиваться смертельным исходом. Случаи госпитализации и смерти происходят, в основном, в группах высокого риска. По оценкам ВОЗ, ежегодные эпидемии гриппа приводят к 3-5 миллионам случаев тяжелой болезни и к 290 000 – 650 000 случаев смерти от респираторных заболеваний.

Люди болеют гриппом в любом возрасте, но есть группы населения, подверженные повышенному риску. Повышенному риску развития тяжелой болезни или осложнений в результате инфицирования подвергаются:

Беременные женщины, дети в возрасте до 59 месяцев, пожилые люди, люди с хроническими нарушениями здоровья (такими как хронические болезни сердца, легких и почек, нарушения метаболизма, нарушения неврологического развития, болезни печени и крови) и люди с ослабленным иммунитетом (в результате ВИЧ/СПИДа, химиотерапии или лечения стероидами, а также в связи со злокачественными новообразованиями).
Работники здравоохранения подвергаются высокому риску инфицирования вирусом гриппа во время контактов с пациентами и могут способствовать дальнейшей передаче инфекции, особенно людям из групп риска.
Источник инфекции – больной человек с конца инкубационного периода и весь лихорадочный период (пока сохраняется повышенная/высокая температура).

Инкубационный период гриппа, как правило, составляет 2 дня, но может колебаться от 1 до 4 дней.
Большую опасность для окружающих представляют больные с легкой формой заболевания. Оставаясь на ногах и продолжая вести активный образ жизни, они успевают заразить большое число людей.
Наиболее эффективным способом профилактики болезни является вакцинация. Организму требуется минимум две недели для выработки антител, следовательно, прививку нужно делать не позднее, чем за 2-3 недели до наступления эпидемиологического сезона. Вот уже более 60 лет имеются и используются безопасные и эффективные вакцины. ВОЗ рекомендует ежегодную вакцинацию для следующих групп населения:

беременные женщины на любом сроке беременности
дети в возрасте от 6 месяцев до 5 лет
пожилые люди (старше 65 лет)
люди с хроническими нарушениями здоровья
работники здравоохранения.
Помимо вакцинации и противовирусного лечения мероприятия общественного здравоохранения включают меры индивидуальной защиты, такие как:

регулярное мытье и надлежащее высушивание рук;
надлежащая респираторная гигиена – прикрытие рта и носа при кашле и чихании салфетками с их последующим надлежащим удалением;
своевременная самоизоляция людей, почувствовавших себя нездоровыми, с высокой температурой и другими симптомами гриппа;
предотвращение тесных контактов с больными людьми;
предотвращение прикасаний к глазам, носу и рту.
Вирусы гриппа обладают высокой изменчивостью. Вследствие чего один и тот же тип вируса гриппа изменяется год от года. Поэтому иммунитет, сформировавшийся в прошлом году, может оказаться неспособным противостоять инфекции в текущем году. Вакцины обычно содержат три вирусных штамма (2 вируса гриппа А и 1 вирус гриппа В), представляющих наиболее распространенные патогенные вирусы, циркулировавшие в популяции в предшествующем сезоне.

Документы, регламентирующие вакцинацию против гриппа:

Федеральный закон от 17.09.1998 № 157-ФЗ «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней»;
Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.2.3117-13 «Профилактика гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций»;
Приказ Министерства здравоохранения РФ от 31.01.2011 № 51н «О национальном календаре профилактических прививок и календаре профилактических прививок по эпидемическим показаниям».
Сопротивляемость организма к простудным заболеваниям повышают:

· Физическая активность

· Закаливающие процедуры

· Полноценное питание

· Соблюдение режима дня

· Отказ от употребления табака и алкогольных напитков.

С целью призыва населения к участию в кампании вакцинации против гриппа,

Городской центр медицинской профилактики рекомендует:

· Вести работу со средствами массовой информации, посвященную профилактике гриппа;

· Провести мероприятия для медработников, в том числе обсуждения, круглые столы и семинары;

· Организовать проведение лекций и групповых бесед для населения;

· Оформить тематические стенды;

· Подготовить выступления по местной радиотрансляционной сети и кабельному телевидению, публикацию статей в СМИ;

· Разместить на сайтах и стендах учреждений информационный баннер (в приложении) и информацию о необходимости вакцинации.

Об основных различиях между симптомами коронавируса COVID-19, простудных заболеваний и гриппа

Вспышка инфекционного заболевания, вызванного новой коронавирусной инфекцией (COVID-19) продолжает развиваться, и на фоне этого проводится сравнение данного заболевания с гриппом.

Обе болезни являются респираторными заболеваниями, но между этими двумя вирусами и тем, как они распространяются, есть важные различия. Это важно с точки зрения того, какие медико-санитарные меры могут быть приняты для реагирования на каждый вирус.

Вопрос: Чем похожи COVID-19 и вирусы гриппа?

Во-первых, COVID-19 и вирусы гриппа имеют сходную картину заболевания. То есть они оба вызывают респираторное заболевание, которое представляет собой широкий спектр вариантов болезни – от бессимптомного или легкого до тяжелого заболевания и смерти.

Во-вторых, оба вируса передаются при контакте, воздушно-капельным путем и через фомиты. В силу этого, важные медико-санитарные меры, которые все могут предпринимать для предотвращения инфекции, являются одинаковыми, например: гигиена рук и соблюдение дыхательного этикета (кашлять в локоть или в бумажный платок с последующим незамедлительным выбрасыванием).

Вопрос: Чем отличаются COVID-19 и вирусы гриппа?

Важным различием между этими двумя вирусами является скорость передачи.

Грипп имеет более короткий средний инкубационный период (время от заражения до появления симптомов) и более короткий серийный интервал (время между последовательными случаями), чем у вируса COVID-19. Серийный интервал для вируса COVID-19 оценивается в 5-6 дней, в то время как для вируса гриппа последовательный интервал составляет 3 дня. Это означает, что грипп может распространяться быстрее, чем COVID-19.

Кроме того, передача в первые 3-5 дней болезни или, потенциально, предсимптомная передача – передача вируса до появления симптомов – является основной причиной передачи гриппа. В противоположность этому, хотя мы знаем, что есть люди, которые могут распространять вирус COVID-19 за 24-48 часов до появления симптомов, в настоящее время это, по-видимому, не является основной причиной передачи инфекции.

Предполагается, что репродуктивное число – число вторичных случаев заражения, вызванных одним инфицированным человеком – для вируса COVID-19 составляет от 2 до 2,5, что выше, чем для гриппа. Тем не менее, оценки, сделанные для COVID-19 и гриппа, очень контекстуальны и зависят от временного периода, что затрудняет прямые сравнения.

Дети являются важным фактором передачи вируса гриппа в обществе. Для вируса COVID-19 первоначальные данные показывают, что болезнь затрагивает детей меньше, чем взрослых, и частота случаев заболевания с клиническими проявлениями в возрастной группе 0-19 лет является низкой. Дополнительные предварительные данные, полученные относительно домохозяйств в Китае, показывают, что дети заражаются от взрослых, а не наоборот.

В то время эти два вируса имеют похожий спектр симптомов, доля тяжелых случаев, по-видимому, отличается. Для COVID-19 данные на сегодняшний день позволяют предположить, что 80% случаев заражения являются легкими или бессимптомными, 15% – тяжелыми, требующими оксигенации, и 5% критическими, требующими вентиляции. Доли тяжелых и критических случаев выше, чем те, которые наблюдаются для гриппа.

Больше всего риску тяжелой гриппозной инфекции подвержены дети, беременные женщины, пожилые люди, лица с хроническими заболеваниями и иммунодефицитом. Что касается COVID-19, то в настоящее время мы знаем, что пожилой возраст и сопутствующие заболевания увеличивают риск тяжелой инфекции.

Вопрос: Какие медицинские средства доступны для COVID-19 и вирусов гриппа?

Несмотря на то, что в настоящее время в Китае проводятся клинические испытания ряда лекарственных средств, а в мире разрабатывается более 20 вакцин для COVID-19, в настоящее время нет лицензированных вакцин или терапевтических средств. В то же время, противовирусные препараты и вакцины против гриппа существуют. Хотя вакцина против гриппа не эффективна против вируса COVID-19, настоятельно рекомендуется делать прививки каждый год, чтобы предотвратить заражение гриппом.

Источник информации: http://77.rospotrebnadzor.ru/

(PDF) Стимулируемые оризатенсином PBMC увеличивают прогрессирование рака In-vitro

M. Barati, et al.

126 / Иран J Allergy Asthma Immunol, весна 2017 г., т. 16, No. 2, апрель 2017 г.

Опубликован Тегеранским университетом медицинских наук (http://ijaai.tums.ac.ir)

Подавление приема пищи агонистом C3a комплемента

[Trp 5] -оризатенсин ( 5–9). Пептиды 2007; 28 (3): 602-6.

5. Кодзима М., Вакай К., Тамакоши К., Токудоме С.,

Тойосима Х, Ватанабе Й и др.Диета и колоректальный рак

Смертность от рака: результаты Японского совместного когортного исследования

. Nutr Cancer 2004; 50 (1): 23-32.

6. Минь Х, Лю Ц. , Вэй Й, Ван Н, Юань Г, Лю Д. и др.

Экспрессия и регуляция рецепторов комплемента

естественных киллеров человека. Иммунобиология 2014;

219 (9): 671-9.

7. Разиуддин С., аль-Далаан А., Бахабри С., Сирадж А.К., аль-

Седейри С.Дивергентный профиль продукции цитокинов при болезни Бехчета

. Измененный образец цитокинов клеток Th2 / Th3. J

Rheumatol 1998; 25 (2): 329-33.

8. Теофилопулос А.Н., Кундурис С., Коно Д.Х., Лоусон

BR. Роль IFN-гамма в системной волчанке

erythematosus: вызов парадигме Th2 / Th3 в аутоиммунитетах

. Arthritis Res 2001; 3 (3): 136-41.

9. Браумюллер Х., Видер Т., Бреннер Э., Ассманн С., Хан

М, Алхалед М. и др.Цитокины Т-хелперов-1 приводят к старению

рака. Природа 2013; 494 (7437): 361-5.

10. Эгеблад М., Верб З. Новые функции для матричных металлопротеиназ

при прогрессировании рака. Nat Rev Cancer

2002; 2 (3): 161-74.

11. Ван Д., Ван Х, Го Й, Нин В., Каткури С., Вали В.,

и др. Перекрестное взаимодействие между активированным пролифератором пероксисом рецептором

δ и VEGF стимулирует прогрессирование рака. Proc

Natl Acad Sci U S A 2006; 103 (50): 19069-74.

12. Ducruet AF, Hassid BG, Mack WJ, Sosunov SA, Otten

ML, Fusco DJ, et al. Модуляция рецептора C3a инфильтрации гранулоцитов

после очаговой церебральной ишемии у мышей

зависит от реперфузии. J Cereb Blood Flow

Metab 2008; 28 (5): 1048-58.

13. Юань Ю., Адамс С.Д., Динауэр Д.М., Розенау С.М., Урибе

М.Р., Флегель В.А. 98-P: ЭКСПРЕССИЯ мРНК KIR В

PBMC И ОБОГАЩЕННЫХ NK-КЛЕТКАХ, АНАЛИЗИРОВАННАЯ С помощью

КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР в реальном времени.Hum Immunol

2013; 74: 119.

14. Постоянный SL. В-лимфоциты как антигенпрезентирующие клетки

для примирования CD4 + Т-клеток in vivo. J Immunol 1999;

162 (10): 5695-703.

15. Эванс Д.Е., Манкс М.В., Пуркерсон Дж. М., Паркер, округ Колумбия.

Покоящиеся В-лимфоциты как APC для наивных Т-лимфоцитов:

зависимость от лиганда CD40 / CD40. J Immunol 2000;

164 (2): 688-97.

16. Кидд П. Баланс Th2 / Th3: гипотеза, ее ограничения,

и значение для здоровья и болезней.Альтернативная медицина Ред.

2003; 8 (3): 223-46.

17. Саксена Р., Каур Дж. Цитокины Th2 / Th3 и их генотипы

как предикторы гепатоцеллюлярной карциномы

, связанной с вирусом гепатита В. WJH 2015; 7 (11): 1572-80.

18. Ван Л., Ван И, Сун З, Чу Дж, Цюй X. Дефицит

гамма-интерферона или его рецептора способствует развитию колоректального рака

. J Interferon Cytokine Res 2015;

35 (4): 273-80.

19.Гарсиа-Туньон I, Рикоте М., Руис А., Фрайле Б., Паниагуа Р.,

Ройуэла М. Влияние IFN-гамма и его рецепторов на рак груди

человека. BMC Cancer 2007; 7 (1): 1.

20. Саксена Р., Каур Дж. Цитокины Th2 / Th3 и их генотипы

как предикторы гепатоцеллюлярной карциномы

, связанной с вирусом гепатита В. World J Hepatol 2015; 7 (11): 1572-80.

21. Хун М., Цзян Цзянь, Чжоу Ю.Ф. Влияние термотерапии на

Th2 / Th3-клеток у пациентов с раком пищевода, получавших лучевую терапию

.Азиатский Pac J Cancer Prev 2014; 15 (5): 2359-

62.

22. Reiche EM, Nunes SO, Morimoto HK. Стресс, депрессия,

иммунная система и рак. Ланцет Онкол 2004;

5 (10): 617-25.

23. Mostafazadeh A, Saravi M, Niaki HA, Drabbels J,

Gholipour HM, Minagar M, et al. HLA-DR1, циркулирующие

цитокинов Th2 / Th3 и иммунологические гомункулы в

коронарном атеросклерозе. Иран J Аллергия Астма

Иммунол 2011; 10 (1): 11-9.

24. Протти М.П., Де Монте Л. Перекрестный разговор внутри опухоли

Микроокружение

опосредует воспаление Th3-типа при раке поджелудочной железы

. Онкоиммунология 2012; 1 (1): 89-91.

25. Чехонин В.П., Шеин С.А., Корчагина А.А., Гурина О.И.

VEGF в прогрессии опухоли и таргетной терапии. Curr

Цели по лекарствам от рака, 2013 г .; 13 (4): 423-43.

26. Nishida N, Yano H, Nishida T, Kamura T., Kojiro M.

Ангиогенез при раке.Vasc Health Risk Manag 2006;

2 (3): 213-9.

27. Джалели С., Теохарис А.Д., Караманос Н.К. Роль матриксных металлопротеиназ

в прогрессировании рака и их фармакологическое нацеливание на

. FEBS J 2011; 278 (1): 16-27.

28. Ву Д., Мейдани С.Н. Возрастные изменения иммунной

и воспалительные реакции: влияние вмешательства витамина E

. J Leukocyte Biol 2008; 84 (4): 900-14.

29. Юань М., Кирчер С.М., Ченг К., Зумалан Р., Ташкин

Д.П., Рот М.Д.Δ 9-Тетрагидроканнабинол регулирует баланс цитокинов

Th2 / Th3 в активированных Т-клетках человека. J

Neuroimmunol 2002; 133 (1): 124-31.

Малый токсичный белок сальмонеллы TimP нацелен на цитоплазматическую мембрану и репрессируется малой РНК TimR

РЕФЕРАТ

Малые белки привлекают повышенное внимание в связи с их важными функциями в основных биологических процессах во всех сферах жизни. Однако их небольшой размер и низкая сохранность последовательности затрудняют их идентификацию.Поэтому неудивительно, что энтеробактериальный ryfA избежал идентификации в качестве небольшого гена, кодирующего белок, в течение почти двух десятилетий. С момента его идентификации в 2001 году считалось, что ryfA кодирует некодирующую РНК и участвует в образовании биопленок у Escherichia coli и патогенезе у Shigella dysenteriae. Хотя недавнее исследование профиля рибосом показало, что ryfA должен транслироваться, соответствующий белковый продукт не был обнаружен. В этом исследовании мы представляем доказательства того, что ryfA кодирует небольшой токсичный белок внутренней мембраны, TimP, избыточная экспрессия которого вызывает утечку цитоплазматической мембраны.TimP несет N-концевую сигнальную последовательность, что указывает на то, что его мембранная локализация является Sec-зависимой. Экспрессия TimP подавляется малой РНК (мРНК) TimR, которая спаривается с мРНК timP для ингибирования ее трансляции. В отличие от сверхэкспрессии, эндогенная экспрессия TimP после делеции timR разрешает рост клеток, что, возможно, указывает на независимую от токсичности функцию бактериальной мембраны.

ВАЖНОСТЬ Секвенирование следующего поколения (NGS) позволило выявить огромное количество геномов организмов, охватывающих все сферы жизни.Для уменьшения сложности при аннотировании новых геномных последовательностей открытые рамки считывания (ORF) короче 50 кодонов обычно опускаются. Однако недавно стало очевидно, что эта процедура сортирует ORF, кодирующие небольшие белки, имеющие высокую биологическую значимость. Например, адаптированные подходы к идентификации малых белков показали, что бактерии кодируют множество мелких белков с важными физиологическими функциями. По мере увеличения числа предсказанных малых ORF становится важным охарактеризовать соответствующие белки.В этом исследовании мы обнаружили консервативный, но ранее недооцененный малый белок энтеробактерий. Мы показываем, что этот белок, который мы назвали TimP, является мощным токсином, который подавляет рост бактерий, воздействуя на клеточную мембрану. Токсичность снимается небольшой регуляторной РНК, которая связывает мРНК токсина, подавляя синтез токсина.

ВВЕДЕНИЕ

Аннотации малых открытых рамок считывания (кОРС) в геномных последовательностях являются сложной задачей, поскольку они неотличимы от многочисленных небольших нефункциональных фрагментов генома в рамке считывания.Чтобы уменьшить этот нежелательный фон, большинство инструментов прогнозирования генов применяют отсечки длины ORF, что, однако, создает тенденцию к аннотации более длинных ORF и исключению кОРС короче 50 кодонов в прокариотических и 100 кодонов в эукариотических геномах. В последнее десятилетие эта систематическая предвзятость была признана, и впечатляющий прогресс был достигнут в области идентификации кОРС за счет комбинирования продвинутого компьютерного прогнозирования с экспериментальными методами (1–13), недавно рассмотренными для Escherichia coli в ссылке 14. Эти исследования демонстрируют, что гены небольших белков гораздо более многочисленны, чем предполагалось ранее. Например, более 100 кОРС были экспериментально проверены на модельном организме E. coli (3, 4, 12, 14, 15). Обширное метагеномное исследование микробиома человека выявило более 4000 предполагаемых малых семейств белков, что указывает на скрытый мир малых белков, ожидающих своего исследования (10). Однако, поскольку характеристика малых белков началась только недавно, функции большинства предполагаемых малых белков в настоящее время неизвестны.

До эры общегеномных открытий генов малых белков, индивидуальные открытия на протяжении многих лет показывали, что, как и их более крупные аналоги, малые белки выполняют важные функции во всех сферах жизни. Маленькие белки играют важную роль в развитии организма и выполняют специфические для ниши или ткани функции (см. Примеры с 16 по 18). У бактерий небольшие белки участвуют в центральных клеточных процессах, являясь компонентами рибосом, комплексов цитохромоксидазы или аппарата деления клеток (19, 20). Они также могут действовать как регуляторы конкретных транспортеров (21-25) или путей передачи сигналов (26, 27). Особый класс бактериальных малых белков — это токсины в системах токсин-антитоксин (ТА) типа I.

В E. coli большинство токсинов типа I имеют длину от 18 до 51 аминокислоты, причем токсин IbsB является самым маленьким, а HokD — самым большим в этом диапазоне размеров. Как правило, эти маленькие белки токсичны при сверхэкспрессии, что приводит к остановке роста (обзор систем ТА см. Ссылку 28).Антитоксины систем ТА типа I представляют собой антисмысловые РНК, которые транскрибируются из последовательности, перекрывающейся или расположенной рядом с геном токсина (29). Основания антитоксиновой РНК соединяются с соответствующими мРНК токсина для ингибирования трансляции и / или для индукции деградации мРНК (30). Антитоксины обычно более лабильны, чем мРНК токсина. Поэтому было высказано предположение, что токсин может влиять на клетки в физиологических условиях, в которых синтез антитоксина остановлен и / или антитоксин разрушается (28). Поскольку трансляция токсина типа I обычно подавляется во время роста в обычных лабораторных средах, большинство исследований этих систем проводилось с эктопической экспрессией компонентов системы. Эти исследования показали, что при сверхэкспрессии из плазмиды токсины типа I по-разному повреждают клетки, часто за счет нарушения цитоплазматической мембраны (31). Это происходит либо за счет олигомеризации токсина и образования пор в мембране, что приводит к деполяризации и утечке мембраны (32, 33), либо за счет вмешательства в синтез мембраны, либо за счет нарушения организации мембраны (33).Считается, что токсины типа I, повреждающие мембраны, проникают непосредственно в мембрану без помощи механизмов для введения мембраны, таких как система Sec. Однако, хотя большинство токсинов типа I представляют собой небольшие гидрофобные белки, нацеленные на мембрану, SymE и RalR являются исключениями из этого правила, поскольку они, по-видимому, действуют как нуклеазы, опосредуя токсичность (34, 35). В то время как молекулярные механистические детали систем ТА изучены подробно, их биологические функции менее понятны. Сообщалось, что системы ТА вызывают гибель клеток при неблагоприятных условиях (например,g., постсегрегационное убийство и абортивная инфекция) или контролируемая активация токсинов может вызвать временное состояние покоя, которое способствует устойчивости к стрессу (28).

Здесь мы описываем открытие токсичного гена, кодирующего белок, и его антисмыслового репрессора, кодируемого в геномной области гена ryfA в сероваре Typhimurium Salmonella enterica. Мы показываем, что хотя ryfA изначально был аннотирован для кодирования некодирующей РНК (36), он содержит небольшую ORF.Эта ORF транслируется в небольшой белок из 38 аминокислот, который токсичен при сверхэкспрессии. Белок несет каноническую сигнальную последовательность и локализован в цитоплазматической мембране. Токсичность подавляется малой РНК (мРНК), дивергентно кодируемой из ryfA , расположением генов, напоминающим систему ТА типа I. Основываясь на результатах, представленных в этом исследовании, мы предлагаем переименовать ryfA в timP (токсичный белок внутренней мембраны) и его ген репрессорной мРНК в timR (репрессор timP ).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сверхэкспрессия timP приводит к ингибированию роста. Ген timP (ранее ryfA ) в E. coli K-12, расположенный между sseA (кодирующим 3-меркаптопируват-серотрансферазу ) и (повышающий чувствительность к серину B), первоначально было предложено кодировать 300-нуклеотидную (нт) некодирующую РНК (36). Гомологи этой РНК были связаны с вирулентностью у Shigella (37) и образованием биопленок у патогенных E.coli (38). Геномный контекст timP в Salmonella серовар Typhimurium штамм SL1344 (далее Salmonella ) отличается от такового для K-12 тем, что ген неизвестной функции, STM2534 , аннотирован между sseA и timP. Кроме того, не охарактеризованный ген мРНК timR (ранее STnc2070 ) аннотирован рядом с timP (фиг. 1A; см. Также фиг. S1 в дополнительном материале). Во время наших первых экспериментов, направленных на характеристику функции timP в Salmonella , мы наблюдали, что его сверхэкспрессия из индуцибельного промотора сильно ингибирует рост бактерий.Во время роста в 96-луночных планшетах в среде, содержащей индуктор, оптическая плотность (OD) штамма со сверхэкспрессией timP почти не увеличивалась в течение 12-часового периода инкубации (фиг. 1B). Аналогично, точечные разведения бактериальных культур на чашках, содержащих индуктор, приводили к сильному снижению количества КОЕ, когда клетки содержали индуцируемую плазмиду timP (фиг. S2). Наблюдаемое ингибирование роста может быть связано либо с временной остановкой роста, которая позволяет клеткам восстановиться после удаления индуктора, либо с токсическим эффектом, который необратимо повреждает клетки.Чтобы проверить это, ночные культуры разводили в 300 раз в среде, содержащей индуктор, в течение 1 часа, после чего экспрессия timP подавлялась промыванием бактерий в среде без индуктора и посевом серийных разведений на планшеты без индуктора. 1-часовая индукция timP привела к сильному снижению (на 4 порядка) количества КОЕ, предполагая, что сверхэкспрессия timP вызывает необратимое повреждение клеток, которое предотвращает возобновление роста (рис. 1C). Наконец, чтобы проверить, может ли сверхэкспрессия timP ингибировать активно растущие клетки, культуры выращивали до среднеэкспоненциальной фазы, после чего добавляли индуктор на 15 мин с последующими промывками и высевом на планшеты без индуктора.Как показано на фиг. 1D, 15-минутный импульс экспрессии timP снижает жизнеспособность на 3 порядка, указывая на то, что активно растущие клетки очень чувствительны к сверхэкспрессии timP .

Фиг. 1. Сверхэкспрессия
TimP ингибирует рост Salmonella серовара Typhimurium. (A) Геномный контекст гена timP в штамме SL1344 серовара Typhimurium Salmonella . (B) Кривые роста клеток дикого типа, несущих пустой контрольный вектор (pBAD33) или индуцибельную арабинозой конструкцию сверхэкспрессии timP (pYMB023) в минимальной среде M9 с добавлением 0. 4% глицерина, 0,1% казаминовых кислот и 0,2% l-арабинозы. Планки погрешностей указывают стандартные отклонения (SD) для 3 независимых трансформантов. Оптическую плотность контролировали при 600 нм во время роста в 96-луночных планшетах. (C) Количество КОЕ бактерий, подвергшихся воздействию l-арабинозы (конечная концентрация 0,2%) в течение 1 часа для индукции экспрессии timP , с последующей промывкой, разбавлением и посевом на чашки с агаром без индуктора. Каждая точка представляет результат, полученный от отдельного трансформанта. Звездочка указывает на образец, в котором не было обнаружено колоний.(D) Анализ пятен на планшетах без индуктора после экспоненциально растущих культур, подвергшихся воздействию 0,2% l-арабинозы в течение 15 мин.
FIG S2
Добавление гистидиновой метки на C-конец TimP не влияет на токсичность. Штамм Salmonella Δ timP трансформировали плазмидными конструкциями, несущими timP ORF, С-конец слитый с указанными аффинными метками. Клетки выращивали в течение ночи в среде LB, и серийные разведения культуры наносили на чашки LB (неиндуцированные) или чашки LB, содержащие 0.2% l-арабиноза (индуцированная). Скачать FIG S2, файл EPS, 0,5 МБ. Авторские права © 2020 Andresen et al.
Этот контент распространяется согласно условиям международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0.

Ген timP кодирует небольшой белок. Хотя предполагалось, что timP кодирует некодирующую РНК (36), недавние данные профилирования рибосом показали, что он может кодировать небольшой белок (обозначенный mia-62 в ссылке 39). . В соответствии с этим, запуск программного обеспечения RNAcode (40) для выравнивания последовательности timP , доступного в Rfam ( ryfA семейство, RF00126), предсказал консервативную ORF, охватывающую nt +145 до +261 относительно стартового сайта транскрипции timP (Рис.2А; Рис. S3) (39). Чтобы проверить, транслировалась ли предсказанная ORF in vivo , последовательность, кодирующую гексагистидиновую метку ( 6 × His ), встраивали непосредственно перед стоп-кодоном ORF в конструкции сверхэкспрессии timP . Вестерн-блоттинг с использованием зонда против His подтвердил экспрессию белка TimP 5 кДа, который начал накапливаться через 5 мин после добавления индуктора (фиг. 2В). Важно отметить, что добавление гистидиновой метки не ухудшало токсичность сверхэкспрессии TimP, тогда как несколько других протестированных меток сильно снижали токсичность (рис.S2). Мутация стартового кодона (ATG в AAG) в ORF timP полностью отменяет синтез TimP без значительного воздействия на уровни мРНК timP (фиг. 2C) и делает сверхэкспрессию timP нетоксичной (фиг. 2D). Это указывает на то, что (i) трансляция TimP начинается с мутантного кодона ATG и (ii) белок TimP, но не мРНК timP , токсичен при сверхэкспрессии.
Рис. 2.
Ген timP кодирует небольшой токсичный белок. (A) Последовательность мРНК timP .Предполагаемая ORF указана желтым, предполагаемая последовательность Шайна-Дальгарно подчеркнута, а сайт связывания TimR выделен фиолетовым цветом. (B) ORF, показанная на панели A, была на С-конце помечена шестью остатками гистидина на конструкции сверхэкспрессии timP , индуцируемой арабинозой (pYMB023 → pLA208). Клетки Salmonella дикого типа, несущие плазмиду timP-6 × His или родительскую плазмиду без метки, выращивали в среде М9. При OD ₆₀₀ 0,3 к культурам добавляли 1-арабинозу для индукции экспрессии timP .Перед индукцией и через 5, 15 и 30 мин клетки собирали для аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом и вестерн-блоттинга. Звездочка указывает на неспецифический сигнал, который служит контролем загрузки. (C) Стартовый кодон ORF timP был мутирован (ATG в AAG) в конструкции сверхэкспрессии timP-6 × His , индуцируемой арабинозой. Штаммы, несущие любую из плазмид pBAD (векторный контроль), pLA208 ( timP-6 × His ) или pLA218 [ timP (ATG → AAG) -6 × His ], выращивали до экспоненциальной фазы в M9-глицерине. средний.После 15 мин индукции 0,2% 1-арабинозы клетки собирали для определения экспрессии timP вестерн- и нозерн-блоттингом. Звездочка указывает на неспецифический сигнал, который служит контролем загрузки. (D) Рост Salmonella , несущих либо контрольный вектор, плазмиду сверхэкспрессии timP (pYMB023), либо плазмиду мутантного стартового кодона timP (pYMB024), измеряли в среде на основе M9 с добавлением 0,2% l- арабиноза для индукции timP .Столбики указывают на оптическую плотность культур через 8 ч после инокуляции (средние значения для трех независимых трансформантов ± стандартное отклонение).
TimP — это белок внутренней мембраны. TimP представляет собой гидрофобный белок длиной 38 аминокислот, большинство гидрофобных остатков которого находится в его N-концевой части (рис. 3A). Мы проанализировали последовательность TimP для предполагаемой сигнальной последовательности системы секреции с использованием трех различных инструментов прогнозирования: SignalP-5.0 (41), PRED-TAT (42) и Phobius (43). С большой вероятностью ( P = 0.99–1,0), все три инструмента предсказывали сигнальную последовательность транслоказы Sec, охватывающую аминокислоты с 1 по 20 (таблица S3). SignalP-5.0, кроме того, предсказал сайт расщепления сигнальной пептидазы I между Ala20 и Asp21. Однако вестерн-блоттинг не выявил продуктов расщепления TimP-6 × His, а показал только полноразмерный белок (фиг. 2B), что указывает на то, что сигнальный пептид не отщепляется. Предполагается, что сигнальная последовательность TimP расщепляется сигнальной пептидазой I, для активности которой требуется короткоцепочечная аминокислота в положениях -1 и -3 от сайта расщепления, чтобы закрепить субстрат в его активном сайте (44).В то время как TimP несет небольшую аминокислоту (Ala) в положении -1 от предсказанного сайта расщепления, он имеет Leu в положении -3, что неблагоприятно для расщепления. Без удаления сигнальной последовательности белки могут транспортироваться через внутреннюю мембрану, но не высвобождаться из нее (45). Действительно, когда мы фракционировали клетки, экспрессирующие TimP-6 × His, мы обнаружили белок во фракции внутренней мембраны вместе с контрольным белком YidC (рис. 3B). Таким образом, TimP является токсичным белком внутренней мембраны, несущим сигнальную последовательность, что предполагает Sec-зависимую локализацию.
Рис. 3.
Малый белок TimP несет предполагаемую сигнальную последовательность системы Sec и нацелен на внутреннюю мембрану. (A) Последовательность TimP в Salmonella серовар Typhimurium штамм SL1344. Гидрофобность каждого аминокислотного остатка оценивается по шкале гидропатичности Кайта-Дулитла (79). (B) Вестерн-блоттинг после фракционирования клеток штамма Salmonella , экспрессирующего TimP-6 × His. Антитела против белков с известной клеточной локализацией были использованы для проверки эффективности фракционирования.Т — нефракционированный образец; OM, наружная мембрана; IM, внутренняя мембрана; ЦП, цитоплазма и периплазма.
Экспрессия TimP приводит к повреждению мембраны. Известно или предполагается, что небольшие токсичные белки, такие как TisB и Hok, образуют поры во внутренней мембране, вызывая утечку через мембрану (32, 46). Одним из исключений является токсин внутренней мембраны Bacillus subtilis BsrG, который вместо того, чтобы влиять на проницаемость мембраны, вызывает аберрантную топологию мембраны с непрерывными инвагинациями мембраны (33). Чтобы исследовать, влияет ли TimP на морфологию клеток и / или проницаемость мембран, мы изучили timP -экспрессирующих клеток с помощью микроскопии.Судя по фазово-контрастному изображению, 1 час индукции timP не привел к каким-либо наблюдаемым морфологическим отличиям от штамма, несущего векторный контроль (фиг. 4A), несмотря на то, что он оказал сильное влияние на рост (фиг. 1C). Напротив, когда мы проанализировали те же образцы на проницаемость для пропидия иода, 86% (± 2,5%) клеток, сверхэкспрессирующих timP , были проницаемы для красителя по сравнению с 3,7% (± 4,2%) для контрольных клеток (рис. 4A и B). Следовательно, сверхэкспрессия timP прямо или косвенно обеспечивает фенотип протекающей мембраны.Исследование, проведенное Фозо и другими, показало, что временная сверхэкспрессия токсинов IbsC, ShoB, LdrD и TisB индуцирует экспрессию гена cpxP (47). CpxP является одним из наиболее выраженных участников стрессового ответа Cpx, который активируется при стрессе клеточной оболочки (48). В соответствии с повреждением внутренней мембраны TimP, слияние транскрипции между промотором cpxP и геном зеленого флуоресцентного белка (GFP) сильно активировалось при сверхэкспрессии timP (рис.4С). Индукция P cpxP-gfp предшествовала снижению оптической плотности, что указывает на то, что повреждение внутренней мембраны происходит до ингибирования роста. Однако активация системы Cpx не требуется для TimP-зависимого ингибирования роста, поскольку токсичность TimP сохраняется в штамме, лишенном CpxR, главного регулятора транскрипции системы Cpx (Fig. S4).
Рис. 4
Сверхэкспрессия timP приводит к негерметичности мембран. (A) Клетки Salmonella , несущие либо векторный контроль (pBAD33), либо конструкцию сверхэкспрессии timP (pYMB023), выращивали в среде на основе M9 до фазы экспоненциального роста. При OD ₆₀₀ 0,35 экспрессия timP была индуцирована из плазмиды путем добавления 0,2% l-арабинозы. Через 1 час индукции клетки окрашивали SYTO9 и пропидиум йодом (PI), ДНК-красителями, которые проходят (SYTO9) или не проходят (PI) через интактные клеточные мембраны. Предоставляются изображения окрашенных клеток с помощью фазового контраста и флуоресцентной микроскопии. Масштабная линейка 15 мкм. (B) Количественная оценка окрашенных клеток (как на панели A) в трех независимых экспериментах. Окрашиванием обозначены клетки, содержащие SYTO9 (зеленый), йод пропидия (красный) или оба красителя (желтый).Цифры под столбцами, сложенными вместе, указывают количество клеток, проанализированных для каждой повторности. (C) Клетки, несущие репортерную конструкцию P cpxP — gfp (pYMB011), выращивали в присутствии (p timP ) или в отсутствие (pBAD) индуцибельной конструкции экспрессии timP (pYMB016). Клетки выращивали в LB, содержащем 0,2% l-арабинозы. Линии показывают средние значения от трех независимых трансформантов, измеренные в двух технических повторностях. Затенение под линиями указывает на стандартные отклонения измерений.
FIG S4 Активация системы
Cpx не требуется из-за токсичности TimP. Штаммы дикого типа и Δ cpxR трансформировали конструкцией сверхэкспрессии timP (pYMB023) или соответствующим векторным контролем (pBAD33). Клетки выращивали в присутствии 0,2% l-арабинозы в минимальной среде на основе М9. Рост бактерий измеряли в ранней стационарной фазе (через 8 часов после инокуляции). Столбцы показывают средние значения от трех независимых трансформантов ± стандартное отклонение. Скачать FIG S4, файл EPS, 0.1 МБ. Авторские права © 2020 Andresen et al.
Этот контент распространяется согласно условиям международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0.

Экспрессия TimP ингибируется сРНК TimR. Экспрессия малых токсичных белков обычно сильно подавляется и активируется только в определенных стрессовых условиях. Например, транскрипция гена tisB сильно репрессируется транскрипционным фактором LexA, тогда как трансляция мРНК tisB ингибируется как антисмысловой РНК, так и внутренней структурой мРНК (49).В отличие от tisB , мРНК timP экспрессируется на довольно высоких уровнях во всех условиях, протестированных в сборнике экспрессии генов SalCom (50), что позволяет предположить, что она не сильно репрессируется на уровне транскрипции. Действительно, нативно экспрессируемая мРНК timP легко обнаруживается с помощью нозерн-блоттинга в клетках, экспоненциально растущих в среде LB (фиг. 5A). Напротив, вестерн-блоттинг штамма дикого типа, в котором нативная ORF timP была помечена гистидиновой меткой, не смог обнаружить белок (фиг.5Б). Точно так же предыдущее исследование не смогло обнаружить нативно экспрессируемый последовательный пептидно-меченый TimP (39). По-видимому, хотя мРНК timP имеется в большом количестве, она плохо транслируется, что указывает на тормозной посттранскрипционный механизм. Ген timP фланкирован не охарактеризованным геном мРНК STnc2070 , здесь переименованным в timR (фиг. 1A). Ранее было показано, что гомолог TimR Shigella dysenteriae, RyfB1, снижает уровни РНК -гомолога timP RyfA1 при сверхэкспрессии из плазмиды (37).В том же исследовании было предсказано прямое взаимодействие между RyfA1 и RyfB1 РНК, но никаких экспериментальных доказательств этого взаимодействия предоставлено не было. Чтобы проверить, влияет ли TimR на экспрессию timP в Salmonella , мы проанализировали мРНК timP и уровни TimR с помощью нозерн-блоттинга и уровни TimP с помощью вестерн-блоттинга. Нозерн-анализ показал, что делеция одного гена существенно не влияла на экспрессию другого (фиг. 5А). Однако делеция timR привела к значительному увеличению уровня белка TimP-6 × His, что указывает на то, что (i) TimP экспрессируется не только при сверхэкспрессии, но и из своего нативного локуса, и (ii) мРНК TimR отрицательно влияет на трансляция TimP (рис. 5Б). Следует отметить, что конструкция для сверхэкспрессии давала в ~ 350 раз более высокие уровни TimP, чем нативная экспрессия при делеции timR (фиг. 5B). В соответствии с TimR, репрессирующим продукцию TimP, плазмида, конститутивно сверхэкспрессирующая TimR, полностью устраняет токсичность конструкции сверхэкспрессии TimP (фиг. 5C).
Рис. 5.
TimR ингибирует экспрессию timP и противодействует TimP-зависимой токсичности. (A) Нозерн-блоттинг РНК, экстрагированной из указанных клеток штамма Salmonella , выращенных в LB до OD ₆₀₀ 0.4. Множественные полосы, обнаруженные при использовании зонда против TimR, могут указывать на процессинг этой РНК. Указанные приблизительные длины мРНК timP, и TimR были определены с использованием логарифмической функции на основе измеренной длины от лунок геля до каждой полосы маркера размера. (B) Вестерн-блоттинг штаммов Salmonella дикого типа и Δ timR , несущих His-метку в нативном локусе timP , выращенных в среде LB до OD 2. Перед загрузкой геля TimP-6 × Его белок был сконцентрирован с использованием очистки на основе Ni.Образец из штамма со сверхэкспрессией TimP-6 × His служил эталоном. Звездочка указывает на неспецифический сигнал и служит для контроля загрузки. (C) Рост штамма Salmonella Δ timP Δ timR , несущего плазмиды, сверхэкспрессирующие timP и / или timR . Точки данных показывают средние значения от 3 независимых трансформантов. Заштрихованные области представляют стандартное отклонение. wt, дикий тип; v1 и v2, пустые векторы.
TimR связывается непосредственно с мРНК timP , подавляя трансляцию.Чтобы проверить, может ли TimR связываться напрямую с мРНК timP , мы использовали алгоритм IntaRNA (51) для поиска комплементарных последовательностей. Это выявило непрерывный участок комплементарности длиной 18 нуклеотидов между 5′-областью TimR и 5’UTR мРНК timP , что указывает на то, что эти РНК могут взаимодействовать с in vivo (фиг. 6A; фиг. S5). Чтобы проверить это, мы мутировали предсказанные сайты взаимодействия в конструкциях сверхэкспрессии timR и timP так, чтобы комплементарность была восстановлена при объединении двух мутантов (рис.6А). Десятикратные разведения ночных культур, экспрессирующих комбинации пар TimR / timP дикого типа и мутантных пар, наносили на чашки с агаром, содержащими l-арабинозу, для индукции экспрессии timP (фиг. 6B). В то время как TimR дикого типа полностью избавлял клетки от токсичности TimP, комбинации мутант / дикий тип были токсичными (TimR-M6 / timP и TimR / timP -M6). Однако объединение двух мутантов, тем самым восстанавливая комплементарность, также восстанавливает TimR-зависимое спасение от токсичности.Эти результаты убедительно указывают на то, что пары оснований TimR связаны с предсказанной областью в мРНК timP in vivo , что приводит к ингибированию синтеза TimP. Чтобы проверить это явно, мы выполнили анализов трансляции in vitro с использованием мРНК timP — 3 × flag в присутствии или в отсутствие TimR. Повышение концентрации TimR специфически снижало скорость синтеза TimP-3 × FLAG, тогда как трансляция неродственной мРНК ( dgcM — 3 × flag ) увеличивалась или осталась неизменной (рис.6С). Мы пришли к выводу, что TimR представляет собой мРНК антисмыслового типа, которая связывается с комплементарной областью в 5’UTR мРНК timP для ингибирования трансляции.
Рис. 6.
TimR ингибирует трансляцию timP за счет прямого взаимодействия РНК-РНК. (A) Предсказанная комплементарная последовательность между мРНК timP и мРНК TimR. M6, мутации, введенные в конструкции сверхэкспрессии timP и timR , проанализированные в панели B. (B) Гены timR и timP с мутациями M6 или без них были клонированы под промоторами P lac и P araBAD в совместимые плазмиды.Эти гены экспрессировались либо независимо, либо в сочетании в клетках Salmonella путем нанесения разведений ночных бактериальных культур (выращенных без l-арабинозы) на чашки LB с (индуцированной) или без (неиндуцированной) l-арабинозы (конечная концентрация 0,2%). (C) Белки TimP-3 × FLAG (мишень) и DgcM-3 × FLAG (контроль) были синтезированы в бесклеточной системе трансляции с использованием соответствующих мРНК в качестве матриц. TimR был добавлен к образцам перед микшированием трансляции, где указано.Продукты трансляции анализировали вестерн-блоттингом с использованием антитела против FLAG. Звездочка указывает на крупный белковый продукт, который может представлять олигомеры TimP или TimP в комплексе с компонентами набора для трансляции in vitro .
Нативная экспрессия TimP вызывает низкий уровень мембранного стресса, но не влияет на рост. Данные, представленные на рис. 1, показывают, что избыточная экспрессия TimP высокотоксична и приводит к необратимому ингибированию роста. Однако условия, при которых может индуцироваться нативный TimP, неизвестны.Экспрессия TimR в значительной степени конкурирует с экспрессией мРНК timP во всех условиях, протестированных в SalCom compendium (50), предполагая, что в этих условиях синтез TimP должен подавляться. МРНК timP , по-видимому, более стабильна, чем TimR, по оценке эксперимента с рифампицином (фиг. S6A), предполагая, что состояние, при котором репрессируется транскрипция timR , позволит трансляцию более стабильной мРНК timP . В отсутствие естественного условия индуцирования TimP мы использовали штамм Δ timR в качестве заместителя для индукции эндогенного TimP.Интересно, что хотя делеция timR позволяет транслировать timP (фиг. 5B), она не влияет на рост клеток, который контролируется измерением оптической плотности (фиг. S6B-D). Хотя это указывает на то, что низкие уровни TimP не приводят к серьезной токсичности, все же могут быть более тонкие эффекты на физиологию клеток. Чтобы проверить это, мы использовали транскрипционное слияние P cpxP-gfp , которое сильно активируется при сверхэкспрессии TimP (фиг. 4C). Используя одноклеточные измерения, мы смогли обнаружить небольшое, но значительное увеличение экспрессии cpxP-gfp в штамме Δ timR по сравнению с таковым в штамме дикого типа (рис. 7А). Сдвиг уровней GFP, обнаруженный в штамме Δ timR , был восстановлен до уровней дикого типа после дополнительной делеции timP (фиг. 7B), что указывает на то, что активация cpxP зависела от timP .
Рис. 7.
Индукция экспрессии TimP при делеции timR приводит к TimP-зависимой активации промотора cpxP . (A) Анализ проточной цитометрии штаммов Salmonella дикого типа и Δ timR , несущих транскрипционный репортер P cpxP — gfp , во время роста в среде LB до OD ₆₀₀, равного 2.(B) Фракции клеток дикого типа, Δ timR , Δ timP или Δ timP Δ timR культур, которые имеют более высокую экспрессию P cpxP — gfp , чем установленный порог (GFP > 40 условных единиц [у.е.]). Столбцы показывают среднее значение результатов двух независимых биологических повторов ± стандартное отклонение.
ФИГ. S6
(A) Клетки дикого типа Salmonella выращивали в среде SPI-2 до OD ₆₀₀ 0,3. Транскрипцию останавливали добавлением рифампицина к питательной среде.Распад мРНК timP и мРНК TimR оценивали с помощью Нозерн-блоттинга общей РНК, собранной до и в указанные моменты времени после добавления рифампицина. (B – D) Кривые роста указанных штаммов Salmonella , выращенных в среде LB (B), минимальной среде M9 с добавлением 0,4% глицерина и 0,1% казаминокислот (C) или среде SPI-2 (D). Оптическую плотность при 600 нм контролировали во время роста в 96-луночных планшетах. (От E до G) Фенотипический анализ штаммов с делецией timP и timR .(E) Связанный с биопленкой фенотип rdar был исследован путем нанесения бактериальных культур либо на обычные чашки LB, либо на чашки с низким содержанием соли, содержащие конго красный. Фенотип rdar визуализировали через 3 дня инкубации при 28 ° C. Штамм с делецией cspCE служил в качестве положительного контроля для нарушения морфологии rdar. (F) Формирование клеток-персистеров исследовали, подвергая бактерии, экспоненциально растущие в среде M9-глюкозы, высокой дозой (в 100 раз превышающей МИК) ципрофлоксацина. Образцы, взятые через 3 и 5 ч после добавления ципрофлоксацина, разбавляли и высевали на чашки LB без антибиотиков.Частоту персистирования получали путем сравнения количества КОЕ, полученных до и после лечения антибиотиками. Столбцы показывают средние значения для трех биологических повторов. Отдельные значения показаны точками. (G) Чувствительность мутантов системы TimP-TimR к бактериофагу P22 сравнивали с таковой у штамма ΔflhDC . Ночные культуры разводили в среде LB до OD 0,01 и выращивали в аэробных условиях в течение 1 часа. К культурам добавляли P22 и определяли количество БОЕ на миллилитр 5.5 ч после заражения. Столбцы показывают средние значения для трех биологических повторов. Отдельные значения показаны точками. Скачать FIG S6, файл EPS, 1,6 МБ. Авторские права © 2020 Andresen et al.
Этот контент распространяется согласно условиям международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0.

timP -TimR также кодируется другими энтеробактериями. Согласно Rfam, гомологи РНК timP присутствуют во многих видах энтеробактерий (RF00126).Присутствие начальных и стоп-кодонов в кадре указывает на то, что все эти последовательности обладают потенциалом кодировать гомологи TimP (фиг. S3). Выравнивание аминокислотных последовательностей TimP показало, что N-концевая часть, содержащая сигнальную последовательность, более консервативна, чем C-концевая область (фиг. 8A). Чтобы увидеть, фланкированы ли гены timP мРНК, как в случае TimR в Salmonella , мы искали гомологи перед timP на предмет комплементарных последовательностей.Поразительно, что у всех проанализированных видов последовательности, комплементарные соответствующей 5′-нетранслируемой области timP (5’UTR), были обнаружены выше и на противоположной цепи от каждого гена timP . За комплементарными последовательностями следовали внутренние терминаторы, что позволяет предположить, что они, как TimR, представляют антисмысловые РНК и ингибиторы фланкирующего гена timP . Кроме того, расположение сайтов взаимодействия TimR относительно сайтов ORF timP высоко консервативно между видами (рис.8Б). Таким образом, регуляция экспрессии timP с помощью TimR-подобных мРНК, по-видимому, является общим признаком всех энтеробактерий.
Рис. 8.
Сохранение TimP-TimR в энтеробактериях. (A) Сохранение аминокислотной последовательности TimP у различных видов энтеробактерий. Выравнивание множественных последовательностей визуализировали с помощью Jalview, а аминокислотные остатки окрашены в соответствии с сходством их физико-химических свойств (окраска Zappo [80]). (B) виды энтеробактерий, несущих timP , кодируют гомолог мРНК TimR, который имеет обширную комплементарность между его 5′-концом (красный) и отрезком нуклеотидов в 5’UTR мРНК timP (синий).
ОБСУЖДЕНИЕ
На сегодняшний день описано не менее 19 ТА модулей типа I в E. coli (28). Для штамма Salmonella SL1344, являющегося предметом настоящего исследования, известно только семь систем ТА типа I. (52). Повышенное количество ТА-локусов в бактериальных геномах часто совпадает с величиной изменений в окружающей среде в зависимости от образа жизни вида (53–55). Поскольку Salmonella сталкивается с динамическими изменениями окружающей среды как внутри, так и за пределами хозяина, небольшое количество систем ТА типа I, идентифицированных в этом организме, вероятно, будет недооценено.Идентификация систем ТА типа I затруднена из-за тех же проблем, что и идентификация генов малых белков в целом: гены токсинов не аннотированы в геномах из-за их небольшого размера и низкой консервативности последовательности белкового продукта. По сравнению с другими небольшими белками, токсины типа I еще сложнее идентифицировать экспериментально. Экспрессия токсина сильно подавляется в обычных лабораторных условиях, что приводит к (i) штаммам с делецией токсина, лишенным очевидных фенотипов, и (ii) избеганию подходов, основанных на экспрессии белков, таких как протеомика, иммуноблоттинг и профилирование рибосом.
В данном исследовании мы описываем локус серовара Salmonella Typhimurium timR-timP , который напоминает ТА-модули типа I с точки зрения следующего. (i) Его генная структура аналогична таковой у shoB-ohsC , tisB-istR1 , zor-orz и dinQ-agrB в E. coli (29), как timR и timP дивергентно транскрибируются с непосредственно соседних генов. (ii) Сверхэкспрессия timP токсична для бактериальной клетки, что является общей характеристикой всех токсинов системы ТА (28).(iii) -timP Трансляция мРНК репрессируется антисмысловой мРНК, которая применима ко всем системам ТА типа I (30). (iv) TimR менее стабилен, чем мРНК timP (фиг. S6A), потенциально позволяя экспрессию TimP при стрессах, которые приводят к репрессии транскрипции timR . (v) Сверхэкспрессия TimP влечет за собой повреждение мембраны, наиболее частый результат сверхэкспрессии токсина I типа (28). Однако, несмотря на это очевидное сходство с системами ТА типа I, система TimR / P демонстрирует некоторые важные отличия. Во-первых, процессинг мРНК необходим для эффективной трансляции мРНК многих токсинов типа I, включая tisB , hok , zorO , shoB , dinQ и aapA1 (30, 56–61). Напротив, тот факт, что полноразмерная мРНК, но не более короткие изоформы, детектируется с помощью нозерн-блоттинга (рис. 5A) и что полноразмерная мРНК timP эффективно транслируется in vitro (рис. 6C), предполагает что обработка мРНК не требуется для экспрессии TimP.Во-вторых, хотя TimP локализуется на цитоплазматической мембране, как и большинство токсинов типа I, это может зависеть от другого механизма. TimP несет на своем N конце предсказанную сигнальную последовательность Sec системы, что позволяет предположить, что он использует транслокон Sec для встраивания в мембрану. Все известные токсины типа I, нацеленные на мембрану, не имеют сигнальной последовательности и встраиваются через свои характерные трансмембранные домены. Это может указывать на то, что TimP имеет механизм действия, отличный от, например, механизмов действия токсинов HokB и TisB, которые образуют поры в липидном бислое (32, 46).
Один из важных вопросов заключается в том, какими биологическими функциями обладает TimP. Существует широкий спектр функций, описанных для малых белков, связанных с мембраной, у бактерий, тогда как биологические функции для систем ТА типа I менее ясны (31). Как упоминалось выше, функции токсинов типа I сложно изучить, поскольку экспрессия токсинов подавляется в нормальных условиях роста. По этой причине многие исследования систем ТА были проведены с использованием эктопической экспрессии токсина, часто приводящей к концентрациям клеточного токсина, которые намного превышают то, что вероятно когда-либо могло быть достигнуто за счет эндогенной экспрессии.В соответствии с этим было высказано предположение, что токсины могут подавлять рост или убивать клетки дозозависимым образом (62). Это вызывает беспокойство по поводу того, действуют ли маленькие белки, кодируемые системами ТА, как токсины, когда они экспрессируются из своих природных локусов. Примечательно, что токсичность из-за сверхэкспрессии не редкость для белков с хорошо изученными клеточными функциями, не связанными с токсичностью. Вместе с тем было показано, что некоторые системы ТА типа I вносят вклад в важные физиологические процессы, включая образование клеток-персистеров, выживание при УФ-повреждении и рециклинг поврежденной РНК, образующейся в условиях стресса SOS (34, 59, 62, 63).Сверхэкспрессия timP из индуцибельного промотора вызывает ингибирование роста и утечку через мембрану. Это может происходить из-за развитой функции или из-за нефизиологических эффектов, достигаемых сверхэкспрессией (например, путем разрушения внутренней мембраны из-за перенаселенности гидрофобным белком, агрегации TimP [Рис. 2B и 5B], блокирования трансклокона Sec, или через неблагоприятное воздействие на предполагаемых партнеров по взаимодействию), что, следовательно, приводит к системной реакции. Следовательно, на данном этапе мы воздерживаемся от предположений о биологической функции TimP на основе наших экспериментов по сверхэкспрессии, главным образом потому, что наши данные показывают, что освобождение эндогенно экспрессируемой мРНК timP от репрессии TimR позволяет трансляцию TimP, однако без видимого влияния на рост (рис. S6B-D). Какую предполагаемую роль TimP может играть в физиологии бактерий и / или выживании? Ранее было показано, что гомолог timP в глазном патогене (штамм E. coli L-1216/2010) влияет на образование биопленок, влияя на образование curli fimbriae и целлюлозных нановолокон (38). Однако удаление одного или обоих компонентов системы timPR в Salmonella не повлияло на биопленко-зависимый морфотип rdar (красный, сухой и грубый) (рис. S6E), что указывает на то, что образование биопленок не является универсальным фенотипом. до системы timPR в различных бактериях.Что касается других фенотипов, ранее ассоциированных с системами ТА типа I, мы не смогли наблюдать значительного эффекта делеций timR и / или timP ни на образование клеток-персистеров, ни на инфекцию бактериофага P22 (фиг. S6F и G). Хотя мы не обнаружили четкого фенотипа для мутантов tim у Salmonella , результаты нашего репортера стресса оболочки Cpx (слияние P cpxP-gfp ) показали умеренный стресс в делеционном штамме timR , что позволяет предположить, что хромосомная экспрессия timP может оказывать физиологически релевантное воздействие на бактерии. Мы ожидаем, что будущие исследования прольют свет на физиологические функции TimP и прояснят, зависят ли они от его токсической активности.
Один из путей к пониманию физиологического контекста, в котором TimP может играть роль, — это определение условий, которые способствуют его экспрессии. В Salmonella мРНК timP активируется в макрофагах и условиях, имитирующих клетки-хозяева (50), сильно подавляется (p) ppGpp и одним из немногих обнаруживаемых транскриптов после длительного голодания и высыхания (64, 65).Это намекает на то, что система timPR реагирует на стресс. Однако, поскольку трансляция TimP контролируется TimR, транскриптомные данные только по уровням мРНК timP могут быть плохим индикатором экспрессии TimP. Подходы к скринингу, которые отслеживают экспрессию TimP / TimR при многих различных условиях роста, предпочтительно в отдельных клетках или идентифицируют регуляторные факторы, могут помочь нам понять, когда и как экспрессируется TimP для выполнения своей функции.
Другой важный вопрос касается того, как TimR управляет выражением TimP.Сверхэкспрессия TimR устраняет зависимую от TimP токсичность, а делеция timR индуцирует экспрессию TimP (фиг. 5). 5′-конец TimR комплементарен timP 5’UTR, и мутации в комплементарных последовательностях любой из РНК отменяют TimR-зависимое спасение от токсичности TimP (фиг. 6). В бесклеточной системе трансляции TimR ингибирует трансляцию мРНК timP , но не неродственной контрольной мРНК (рис. 6). Взятые вместе, эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что TimR представляет собой мРНК антисмыслового типа, которая ингибирует трансляцию путем связывания с 5’UTR timP .Как это работает механически? Сайт связывания TimR расположен далеко вверх (> 60 нуклеотидов) от сайта связывания рибосомы timP (RBS) (фиг. 2A и 8; см. Также фиг. S5), что исключает прямую блокировку связывания 30S в RBS, поскольку возможный механизм регулирования. Было описано несколько случаев, когда спаривание оснований sRNAs ингибирует трансляцию путем связывания далеко выше RBS. Классическим примером является ингибирование трансляции repA РНК CopA при контроле количества копий плазмиды R1 (66).CopA нацелен на RBS небольшой вышележащей ORF для ингибирования инициации трансляции, которая необходима для инициации на RBS repA посредством трансляционного связывания (67). timP 5’UTR содержит короткую ORF, которой предшествует последовательность, подобная Shine-Dalgarno, что позволяет предположить, что может быть применим CopA-подобный механизм. Однако отсутствие сохранения ORF, расположенного выше по течению, ставит под сомнение эту гипотезу. Другим примером является мРНК tisB , которая содержит высокоструктурированный RBS, недоступный для прямого входа 30S (68).Здесь одноцепочечная область далеко впереди действует как резервный сайт рибосомы, который обеспечивает временное связывание 30S с последующим перемещением в RBS (56, 69). Родственная антисмысловая мРНК IstR-1 нацелена на резервный сайт, тем самым ингибируя инициацию трансляции (56, 70). Подобный механизм обеспечивает инициацию трансляции в структурированном RBS мРНК zorO (58). Недавнее исследование показало, что мРНК manY содержит восходящий энхансер трансляции, с которым ассоциируется рибосомный белок S1, способствуя инициации трансляции в RBS (71).SRNA SgrS ингибирует трансляцию, нацеливаясь на энхансерную последовательность. Наши текущие данные совместимы с любым механизмом, в котором инициация трансляции в мРНК timP требует наличия вышестоящего элемента, перекрывающего сайт связывания TimR. Однако другие механизмы, например, вовлекающие TimR-зависимые структурные изменения мРНК timP , также должны быть рассмотрены.
Таким образом, мы идентифицировали генетический модуль в Salmonella , который имеет сходство с системами ТА типа I.Дальнейшие исследования покажут, важна ли эта система для регуляции скорости роста бактерий или имеет независимую от токсичности функцию в бактериальной мембране.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы бактерий и условия роста Salmonella enterica subsp. enterica штамм серовара Typhimurium SL1344 использовался на протяжении всего исследования как штамм дикого типа и как родительский штамм для конструирования хромосомных делеций tim (72). Бактерии выращивали в аэробных условиях при 37 ° C в среде LB или в минимальной среде M9 с добавлением 0.1% казаминовых кислот и 0,2% глюкозы или 0,4% глицерина в качестве источника углерода (73). Где указано, добавляли 0,2% 1-арабинозы для индукции экспрессии timP . Для поддержания плазмиды в среду для роста добавляли ампициллин (100 мкг / мл) или хлорамфеникол (15 мкг / мл). Для экспериментов с кривой роста клетки выращивали в 96-луночных планшетах. Культуры встряхивали и измеряли оптическую плотность при 600 нм (OD ₆₀₀) с 5-минутными интервалами. Значения OD ₆₀₀ были нормализованы к контрольным значениям питательной среды.Для анализа пятен была приготовлена серия 10-кратных разведений клеточных суспензий в фосфатно-солевом буфере (PBS). Четыре микролитра каждого разведения наносили пятнами на чашки LB или LB, содержащие 0,2% l-арабинозу, и инкубировали в течение ночи при 37 ° C перед визуализацией.
Молекулярное клонирование и конструирование штаммов. Плазмиды и олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблицах S1 и S2 в дополнительном материале, соответственно. Конструирование векторов сверхэкспрессии timP и timR описано в таблице S1.Мутанты с делецией системы Tim были сконструированы с использованием гомологичной рекомбинации, опосредованной лямбда-красным (74), и олигонуклеотидов EHO-1346 и EHO-1349 для делеции timR , EHO-1347 и EHO-1348 для делеции timP и EHO-1346 и EHO -1347 для с двойной делецией timP / timR (таблица S2). TimP был гексагистидином, помеченным в хромосоме с использованием безрубцового мутагенеза (75) с EHO-1516. Все хромосомные мутации переносили на чистый фон с использованием трансдукции, опосредованной бактериофагом P22, как описано в тексте S1.
Субклеточное фракционирование. ΔtimP Клетки, несущие вектор экспрессии TimP-6 × His (pLA208), выращивали в среде M9-глицерина до достижения OD ₆₀₀ 0,3. Экспрессию индуцировали 0,2% l-арабинозой. После 15 минут индукции при 37 ° C клетки из двух 50-мл культур собирали центрифугированием при 5000 × g в течение 10 минут при 4 ° C. Клетки один раз промывали PBS и хранили при -80 ° C. Две гранулы разморозили на льду с последующим ресуспендированием в 1.5 мл ледяного PBS-E (1 × PBS, содержащий 5 мМ EDTA). Клетки разрушали ультразвуком (3 раза по 15 с каждый раз). Объем пробы довели до 5 мл с помощью PBS-E. Один из образцов был осажден ацетоном, чтобы служить нефракционированным контролем, а другой образец был дополнительно фракционирован следующим образом. Лизат клеток центрифугировали при 100000 × g в течение 1 ч при 4 ° C. Собранный супернатант содержит цитоплазматическое и периплазматическое содержимое. Осадок ресуспендировали в PBS-E и 2% лаурилсаркозинате натрия, детергенте, который специфически растворяет внутреннюю мембрану (76).После 30 мин инкубации при комнатной температуре суспензию центрифугировали при 100000 × g в течение 15 минут при 4 ° C для отделения фракции внутренней мембраны (супернатант) от фракции внешней мембраны (осадка). Осадки ресуспендировали в 1 мл буфера для лизиса, содержащего 5 мМ EDTA (см. «Обогащение TimP-6 × His» ниже). Внутреннюю мембрану и растворимую фракцию осаждали ацетоном и растворяли в буфере для лизиса с 5 мМ EDTA.
Микроскопия. Штаммы выращивали до OD ₆₀₀ 0.3 в среде M9-глицерин. Экспрессию timP индуцировали 0,2% l-арабинозой в течение 1 часа, и клетки окрашивали красителями SYTO и йодидом пропидия (PI) с использованием набора LIVE / DEAD согласно руководству (Invitrogen). Окрашенные клетки улавливали в подушечки из агарозы и визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (увеличение × 100; Nikon Eclipse Ti). Количественное определение клеток с проницаемыми и непроницаемыми мембранами проводили с использованием программного обеспечения ImageJ.
Нозерн-блоттинг. Экстракцию РНК и Нозерн-блоттинг выполняли, как описано в ссылке 77, за исключением того, что для блокирования участков неспецифического связывания на мембране использовали буфер Черча (78). Последовательности олигонуклеотидов, используемых для обнаружения мРНК timP (EHO-1344), TimR мРНК (EHO-1345) и контрольной 5S рРНК (EHO-861), представлены в таблице S2.
Обогащение TimP-6 × His. Если указано, TimP-6 × His обогащали из образцов белка до вестерн-блоттинга следующим образом. Ночные культуры штаммов, несущих либо плазмиду сверхэкспрессии TimP-6 × His (pLA208), либо аллель timP-6 × His в нативном локусе timP на хромосоме, разбавляли до OD ₆₀₀ 0.01 в свежей среде (среда M9 для pLA208, среда LB для хромосомной экспрессии) и выращивали при 37 ° C с перемешиванием при 220 об / мин. Для экспрессии плазмиды, когда культуры достигли ОП ₆₀₀ 0,4, добавляли 1-арабинозу до конечной концентрации 0,2% в течение 15 мин. Для хромосомной экспрессии клетки собирали, когда культуры достигли OD ₆₀₀ 2,0. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 4000 × g в течение 20 мин при 4 ° C. Осадки клеток или белковые экстракты, осажденные ацетоном, растворяли в буфере для лизиса Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA) (100 мМ NaH ₂ PO ₄, 10 мМ трис-HCl, 8 М мочевина, 0. 05% Tween 20, pH 8) и инкубировали на роликах для непрерывной работы в течение 1 ч при комнатной температуре. Двадцать микролитров Ni-NTA магнитных агарозных гранул (Qiagen) уравновешивали в буфере для лизиса Ni-NTA, добавляли к образцу (что соответствует 50 единицам OD в случае экспрессии TimP-6 × His из pLA208 и 800 единиц OD в случае хромосомных экспрессии в штамме Δ timR / timP -6 × His), и инкубировали один за другим в течение 1 ч при комнатной температуре. Гранулы промывали четыре раза равным объемом промывочного буфера Ni-NTA (100 мМ NaH ₂ PO ₄, 10 мМ трис-HCl, 8 М мочевина, 0.05% Твин 20, pH 6,3). Промытые шарики кипятили в 40 мкл буфера для образцов Tricine-SDS-PAGE в течение 5 минут, и супернатант использовали для анализа вестерн-блоттингом.
Вестерн-блоттинг. Образцы белков из экспериментов по субклеточному фракционированию или экспериментов по концентрации на основе Ni-NTA ресуспендировали в загрузочном буфере Tricine-SDS-PAGE (3% SDS, 1,5% β-меркаптоэтанола, 7,5% глицерина, 37,5 мМ Трис-HCl, pH 7, 0,01% кумасси синего G-250) и разделяли на гелях Tricine-SDS-PAGE (Bio-Rad). Белки были перенесены на 0.Мембраны из поливинилидендифторида (ПВДФ) с размером пор 2 мкм с использованием системы переноса TransBlot TURBO и предварительно собранных сэндвичей для переноса (Bio-Rad). TimP-6 × His был обнаружен с помощью конъюгата HisProbe-HRP (ThermoFisher Scientific) и реагентов Amersham ECL Prime в соответствии с протоколами поставщика (GE Healthcare). Белки, меченные FLAG, были обнаружены с использованием моноклональной анти-FLAG M2-пероксидазы (Sigma-Aldrich).
Анализ трансляции in vitro. РНК были транскрибированы in vitro (набор MEGAscript; Life Technologies) из созданной ПЦР ДНК-матрицы ( timP — 3 × flag , олигонуклеотиды EHO-1421 и EHO-1422, ПЦР-матрица pYMB025) или матрица, созданная с помощью фрагмент-зависимого олигонуклеотидного заполнения Кленова (TimR РНК, олигонуклеотиды EHO-1419 и EHO-1420). dgcM — 3 × flag мРНК получали, как описано ранее (78). РНК очищали денатурирующим PAGE с последующей экстракцией фенолом и осаждением этанолом. In vitro трансляцию выполняли с помощью набора для синтеза белка PURExpress in vitro (New England BioLabs) следующим образом. In vitro РНК, транскрибированные с помощью , денатурировали при 95 ° C в течение 5 минут и охлаждали на льду. После добавления TMN буфера (конечные концентрации, 20 мМ Трис, 5 мМ Mg-ацетат, 100 мМ NaCl, pH 7.5) РНК ренатурировали при 37 ° C в течение 5 минут и перемешивали. Для каждой реакции трансляции in vitro 2 мкл компонента A, 1,5 мкл компонента B и 1,5 мкл смеси РНК инкубировали при 37 ° C в течение 20 мин. Реакции останавливали равными объемами буфера для образцов 2 × Tricine-SDS-PAGE на льду.
Измерения GFP. Активность промотора cpxP из репортерной слитой конструкции P cpxP-gfp (pYMB011) измеряли на уровне популяции в культурах, выращенных в среде LB в 96-луночных планшетах (возбуждение, 480 нм; испускание, 520 нм).Флуоресценцию одноклеточного GFP измеряли в культурах, выращенных до OD ₆₀₀ 2 в среде LB, используя проточный цитометр MACSQuant VYB (канал B1, 488 нм / 525/50 нм).
БЛАГОДАРНОСТИ
Эта работа была поддержана Шведским исследовательским советом (грант 2016-03656), Шведским фондом стратегических исследований (грант ICA16-0021), фондами Веннера-Грена, Центром антибиотиков Упсалы и Фондом Оке Виберга. .
Мы не заявляем об отсутствии конфликта интересов.
Мы благодарим Борка Бергхоффа и Герхарта Вагнера за критическое прочтение рукописи, Йорга Фогеля, Яна-Виллема де Гьера и Кристину Йонас за предоставление антител для эксперимента по субклеточному фракционированию, Микаэля Селлина за предоставление штамма Δ cpxR и Софию Берггреном для Нозерн-блот-мембраны, использованной в эксперименте, представленном на рис.S6A.
СНОСКИ
Получено 18 июня 2020 г.
Принято 14 октября 2020 г.
Опубликовано 10 ноября 2020 г.
Авторские права © 2020 Andresen et al.
% PDF-1.6 % 894 0 объект > endobj 496 0 объект > endobj 891 0 объект > поток 2008-04-02T10: 00: 33-04: 002008-04-01T15: 39: 34-04: 002008-04-02T10: 00: 33-04: 00PFU ScanSnap Manager 4.0.19application / pdfuuid: 38901c59-b79c-4052 -9139-996ab32cd263uuid: ef20d362-2a75-4821-be1e-a3f65bae6382Adobe Acrobat 8.1 Подключаемый модуль захвата бумаги конечный поток endobj 852 0 объект > endobj 503 0 объект > endobj 504 0 объект > endobj 505 0 объект > endobj 853 0 объект > endobj 860 0 объект > endobj 866 0 объект > endobj 872 0 объект > endobj 879 0 объект > endobj 885 0 объект > endobj 886 0 объект > endobj 887 0 объект > endobj 888 0 объект > endobj 889 0 объект > endobj 890 0 объект > endobj 481 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> endobj 484 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> endobj 487 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> endobj 490 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> endobj 493 0 объект > / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageB] >> / Type / Page >> endobj 2211 0 объект > поток HWn} WcX_m $ ǒ ލ [R395Npd {cd: T \ r «J) L Փ, Ύ ^ Կ dǣc) qlQb) ~ I5 (. @п Gj [ovW`S & pzIȁ8 j8sYpAEm ~ INQ = \ ΫEU] jUUĪ9}] Ǌ 7f [~ 􄶴, D»BEs Ɣ% cY-ǱUNg @? p6nj RF CvnbkA40; zY ׻) B4 盾 q1kr + ~ 5H E ط J.KmFh5d ߺ߉1 C72) Æhpc3! SR * 3M + Yozq ؄ vC
лечение, симптомы, причины, признаки, лекарственные препараты при ОРИ
ОРИ — полиэтиологическое заболевание, поражающее в первую очередь органы дыхательных путей на разных уровнях, появление которого поражает людей разных возрастных категорий. Среди всех известных инфекционных патологий лидирующие показатели частоты встречаемости имеют ОРЗ, причем данная патология одинаково распространена как в социально развитых странах, так и в странах с пониженным уровнем социальной защиты населения.Столь высокая заболеваемость ОРЗ провоцирует рост нетрудоспособности взрослого населения, что неизбежно наносит значительный вред не только здоровью населения, но и экономике государств по всему миру.
Врачи общей практики должны различать принципиальную важность диагнозов «ОРЗ» и «ОРВИ», исходя из разницы в этиопатогенезе. Например, «ОРВИ» означает исключительно вирусную инфекционную патологию, а «ОРЗ» сочетает в себе заболевания как вирусной, так и бактериальной патологии.
Острое острое респираторное заболевание бактериальной природы чаще всего провоцируется облигатной микрофлорой, которая присутствует у любого здорового человека, но при стрессовых для организма условиях в виде сезонного снижения иммунитета, переохлаждения, клинической картины поражения дыхательная система развивается.
Причины ОРЗ
Заболеваемость различными этиопатогенетическими формами ОРЗ напрямую зависит от эпидемической ситуации по гриппу, наличия спорадических случаев ОРЗ, сезона.
Доля гриппа в общей структуре заболеваемости ОРИ составляет до 70%, что является очень высоким показателем. На втором месте паразитарная инфекция ОРЗ, составляющая до 7,5%. Аденовирусные и респираторно-синцитиальные ОРЗ относятся к категории редких этиопатогенетических форм и составляют не более 10%. Микоплазменные острые респираторные заболевания характеризуются тяжелой степенью выраженности клинических проявлений и, к счастью, частота их возникновения не превышает 10%.
Вирусное происхождение ОРИ установлено у пациентов не более чем в 50% случаев из-за трудоемкости диагностических мероприятий, а оставшиеся 5% ОРИ вызваны бактериальной флорой или вирусами, которые трудно идентифицировать стандартными лабораторными методами. .
Вирусологи выявили более 400 серотипов вирусов, из которых около 140 могут спровоцировать повреждение структур дыхательной системы и вызвать развитие острых респираторных инфекций.В связи с обилием вирусов, циркулирующих в окружающей среде, возможно повторное инфицирование человеческого организма вирусом другого серотипа, что вызывает частое развитие эпизодов ОРЗ у одного и того же человека.
Заражение ОРЗ и ОРЗ любой этиопатогенетической формы происходит путем воздушно-капельного распространения возбудителя от больного или носителя к здоровому. В настоящее время нет случаев передачи возбудителей ОРИ от животных человеку.Основное место для репликации вируса ERI — эпителиальные клетки дыхательных путей, в результате чего появляются тысячи вирионов, которые разносятся на большой площади, сопровождаясь некрозом и слущиванием поверхностных слоев слизистых оболочек дыхательные пути. Интенсивность и степень патоморфологических проявлений напрямую зависят от уровня патогенности возбудителя, его концентрации в организме, а также от состояния функции иммунного аппарата человека.
Особенностью патогенеза ОРЗ бактериального и аденовирусного происхождения является отсутствие того факта, что бактерии и аденовирусы попадают в окружающую среду, так как большинство возбудителей относится к категории условно-патогенных бактерий, постоянно присутствующих в структурах дыхательные пути. Аденовирусные возбудители ОРЗ устойчиво персистируют в организме здорового человека с преобладающей концентрацией в лимфоидных структурах дыхательной системы.Патогенетический механизм развития ОРЗ заключается в резком снижении иммунобиологических реакций человека, на фоне которого в организм попадают инфекционные агенты.
Только гриппозная инфекция подвержена эпидемическому течению острой респираторной инфекции, тогда как другие этиопатогенетические формы этой патологии вызывают единичные эпизоды острого респираторного заболевания, частота которых может превышать таковую гриппа. Общими признаками острого респираторного заболевания, которые наблюдаются при различных этиопатогенетических вариантах течения данной патологии, являются склонность к развитию вспышек в организованных группах и сезонность увеличения заболеваемости.
Симптомы и признаки острого респираторного заболевания
Клиническая классификация не подразумевает разделения на стадии ОРИ, а основана на патогномоничных клинических проявлениях, отличающих одну этиопатогенетическую форму данной патологии от другой. При первом обращении пациента с признаками инфекции дыхательных путей врач не всегда может правильно определить этиопатогенетическую форму заболевания, поэтому может ограничиться заключением «ОРЗ» с указанием уровня поражения дыхательных путей. в виде ларингита, трахеита, бронхита и пневмонии.
После дополнительного обследования пациента и дифференциации клинических признаков заболевания опытный врач может достоверно установить этиологию острого респираторного заболевания, и окончательный диагноз в этом случае будет выглядеть, например, как: «Этиология аденовируса ОРЗ». Тяжесть ОРИ зависит от преобладания интоксикационного синдрома над катаральными проявлениями.
Каждый из этиопатогенетических вариантов ОРЗ характеризуется развитием определенной клинической картины, зная, что врачу легче проверить диагноз на ранних стадиях заболевания.Например, инкубационный период при острых респираторных инфекциях относительно короткий и длится до 48 часов, а продолжительность инкубационного периода вируса напрямую зависит от концентрации и токсичности вируса. Продромальный период при ОРЗ наблюдается не более чем в 15% случаев и проявляется легким дискомфортом, потиранием, болями в мышцах, кратковременным субфебрилитетом. Продолжительность этих мероприятий составляет не более трех часов, поэтому большинство пациентов не придают им должного значения.
Для острых респираторных инфекций этиология гриппа характеризуется острым дебютом клинических проявлений за счет активного размножения вирусных частиц, однако в некоторых ситуациях может наблюдаться постепенное начало клинических проявлений, вплоть до бессимптомного течения.
Во время апогея клинической картины острых респираторных инфекций у пациента появляется озноб, ощущение жара по всему телу, головная боль диффузного типа, головокружение и склонность к кратковременной потере сознания, лихорадка, недомогание и т. слабость, ломота в теле, являющиеся проявлениями синдрома интоксикации.Катаральные симптомы в виде ринита, кашля, потоотделения или боли в горле при глотании чаще всего появляются только на вторые сутки заболевания.
Локализация головной боли при ОРЗ гриппозной этиологии, как правило, лобно-теменной, височной, а по характеру боли диффузные, давящие и интенсивные. Головокружение поражает в основном пожилых людей и детей. Максимальная интенсивность лихорадки отмечается в первый день заболевания, столбик термометра может достигать 40 градусов, а исчезновение его может быть столь же резким, во время которого отмечается потливость и астения.В ситуации, когда продолжительность лихорадочного периода при ОРЗ более десяти дней, пациента следует обследовать на предмет наличия осложнений.
При объективном осмотре больного ОРЗ гриппозной этиологии обращает на себя внимание выраженная гиперемия кожных покровов, а при тяжелом течении заболевания — склонность к акроцианозу, что является признаком гипоксии. повреждение тела. Воспалительное или гипоксическое поражение структур мозга проявляется менингеальными признаками в виде повышенной интенсивности головной боли, тошноты, множественной рвоты, ригидности затылочных мышц и симптомов Кернига.
Катаральные симптомы при ОРЗ гриппозной этиологии сильно выражены и проявляются в виде серозного ринита, фарингита, ларингита, ринофарингита, ларинготрахеита, трахеобронхита. Гиперемия миндалин и задней стенки глотки наблюдается у всех больных и сочетается с гранулезными изменениями слизистой оболочки глотки, мелкой грануляцией мягкого неба.
При острых респираторных инфекциях у младенцев под токсическим воздействием часто создаются условия для развития нейроциркуляторных нарушений, характерных исключительно для гриппозной этиологии острых респираторных инфекций. Токсическое действие на сосуды проявляется в виде увеличения проницаемости их стенок, что приводит к развитию геморрагического диатеза, который проявляется носовыми кровотечениями, кровоизлияниями на слизистых оболочках и коже, геморрагическим отеком легких, гематурией.
Гипертоксическая форма ОРЗ является наиболее тяжелой и проявляется в виде гиперемии, бледности кожи со склонностью к цианозу, обострения черт лица, склерита, сухого кашля, одышки, тахикардии.Патогномоничные соматические признаки гипертоксической формы ОРЗ — геморрагический отек легких, отек мозга и токсический миокардит. Признаками поражения органов сердечно-сосудистой системы является тахикардия с последующей брадикардией, приглушением тонов сердца, гипотонией, токсическими и дистрофическими изменениями миокарда. Лабораторным критерием ОРЗ гриппозной этиологии является выявление в анализе крови умеренного лейкоцитоза с последующей лейкопенией на третьи сутки и незначительным повышением СОЭ.Критериями присоединения к бактериальным осложнениям ОРЗ является появление тяжелого лейкоцитоза со сдвигом нейтрофилов, высокая СОЭ. Осложнения АЕ гриппа всегда вторичны и возникают в результате нарушения кровообращения, проявляющегося в виде пневмонии. В некоторых ситуациях пневмония развивается уже в первый день болезни и тогда ее следует рассматривать как вирусную.
ОРЗ парагриппозной этиологии проявляется умеренно выраженным синдромом интоксикации и катаральными проявлениями, локализующимися преимущественно в носовой и ротовой полости.ОРИ парагриппа может развиться в любое время года, а его инкубационный период составляет в среднем три дня. Для парагриппа ОРЗ не характерно острое начало клинических проявлений, максимальная выраженность клинических проявлений наблюдается при третьем заболевании.
Дебют симптомов проявляется в виде нарастания недомогания, повышения температуры тела, лихорадочных показателей, незначительной головной боли, носового дыхания, сухого кашля. Максимальная температура отмечается на второй день заболевания, а продолжительность лихорадочного периода не превышает девяти дней. Синдром интоксикации при ОРИ парагриппозной этиологии, как правило, средней степени тяжести, а интенсивность его проявлений постепенно увеличивается к третьим суткам. Однако катаральные проявления при парагриппе, напротив, очень выражены и различаются по продолжительности. Объективными признаками ОРЗ в этой ситуации является выраженная зернистая гиперемия свода, глотки и задней стенки глотки при полной сохранности миндалин. Вышеперечисленные патоморфологические изменения провоцируют развитие боли в горле повышенной интенсивности, охриплости голоса и потоотделения в горле до афонии, стойкого лающего сухого кашля.Проявления ринита с парагриппом ОРЗ наблюдаются в 90% случаев и характеризуются появлением сначала слизистых оболочек, а затем гнойных выделений из носовых ходов.
Лабораторные изменения при парагриппе ОРЗ обычно минимальны и проявляются в виде незначительной лимфопении с нормальной СОЭ.
Для ОРЗ аденовирусной этиологии характерны выраженные катаральные проявления и умеренно выраженный интоксикационный синдром. Продолжительность инкубационного периода не превышает шести дней, а дебют клинических проявлений обычно бывает острым. У небольшой части пациентов наблюдается короткий продромальный период, который проявляется недомоганием, кашлем, насморком и отеком горла.
Основное отличие аденовирусных ОРЗ от других этиопатогенетических форм этого заболевания — гепатомегалия, а также диффузное поражение крупных лимфатических узлов, проявляющееся их увеличением и болезненностью. Редкими клиническими симптомами ОРИ аденовирусной этиологии являются наличие полиморфной кожной сыпи и нарушение функции пищеварительной системы.
Продолжительность катаральных проявлений в среднем составляет две недели и характерно сочетание ринита с глоткой. Жалобы больных, страдающих аденовирусным ОРЗ, заключаются в появлении боли в горле и кашле. При ларингоскопии у пациента визуализируется гиперемия слизистых оболочек миндалин, задней стенки глотки, гипертрофия миндалин, а также наличие на их поверхности налета. Особенностью аденовирусного ОРЗ у детей является серозный конъюнктивит, который у взрослых пациентов встречается крайне редко.
ОРЗ бактериальной природы чаще всего проявляется ринитом, ринофарингонзиллитом и ринофарингоброхитом. Одной из форм бактериального ОРИ является болезнь легионеров, которая характеризуется коротким инкубационным периодом и тяжелым течением синдрома интоксикации.
Тяжелое течение болезни легионеров проявляется гектической лихорадкой, болями в груди при дыхании и кашле, ознобом, нарастающей слабостью, мышечными болями и кашлем. Уже в первые сутки болезни у пациента появляются объективные признаки пневмонии с экссудативным плевритом.Рентгенологические признаки ОРЗ в этой ситуации — очаговая инфильтрация, иногда сливающаяся в инфильтраты с умеренным скоплением жидкости в плевральных пазухах. Лабораторными критериями данной патологии являются умеренно выраженный лейкоцитоз со сдвигом нейтрофилов, повышение СОЭ, повышение активности аспартатаминотрансферазы, появление гематурии и протеинурии.
К сожалению, из-за недостаточного знания врачей специфики этого заболевания ранняя диагностика ОРЗ бактериальной природы становится невозможной, что сопровождается повышенным риском летального исхода от острой дыхательной недостаточности и инфекционного шока.Среди пожилых людей наблюдается высокий уровень смертности. Для установления острого респираторного заболевания бактериальной природы одних лишь клинических симптомов недостаточно, в обязательном порядке проводят бактериологический посев мокроты, плевральной жидкости.
Температура при ОРЗ
Лихорадка при ОРЗ — самый частый симптом, и в то же время специалисты с разным профилем неоднозначно относятся к влиянию на этот признак болезни. Большинство людей даже при небольшом повышении температуры тела спешат принять жаропонижающие, особенно детям, при этом понижать температуру при ОРЗ следует далеко не во всех ситуациях.
При применении препаратов, направленных на снижение температуры тела, следует учитывать, что эффект от их применения исключительно симптоматический и эти препараты никоим образом не влияют на течение и тяжесть клинических проявлений острого респираторного заболевания. Основная биологическая роль высокой температуры при острых респираторных инфекциях — это создание своеобразной защиты организмов от негативного воздействия инфекционных агентов.
Каков защитный механизм высокой температуры при острых респираторных инфекциях? В условиях повышенной температурной реакции резко замедляется репликация вирусных частиц и размножение бактериальной флоры, что является основой распространения заболевания и тяжести клинических проявлений.Жаропонижающие средства способствуют снижению температуры тела, при этом не устраняется первопричина ее возникновения и не сокращается общая продолжительность периода лихорадки, однако отмечается период выведения возбудителей болезней. Таким образом, неоспоримым фактом является прямое угнетающее действие жаропонижающих средств на противоинфекционную функцию иммунного аппарата.
Большинство ОРВИ сопровождаются коротким лихорадочным периодом продолжительностью 2-3 дня, тогда как бактериальное ОРЗ характеризуется длительным сохранением повышенной температуры тела, что в большинстве случаев является достоверным основанием для назначения антибактериальных препаратов. В ситуации, когда больной бактериальным ОРИ систематически принимает жаропонижающие препараты, формируется стертая клиническая картина, имитирующая иллюзию благополучия, тем самым повышается риск развития осложнений.
В случае фебрильной лихорадки при ОРЗ, когда цифры на градуснике превышают 40 ° C, защитные функции организма резко снижаются в результате повышенного обмена веществ и потребления кислорода, увеличивая выведение жидкости из организма. .Особенно губительно высокая температура тела сказывается на структуре центральной нервной системы, что проявляется в отеке мозга, повышенной судорожной готовности.
Наиболее пагубно влияет повышение температуры при ОРИ на новорожденных, так как у них может развиться гипертермическое состояние из-за сильной интоксикации и интенсивной воспалительной реакции организма ребенка. Гипертермическое состояние при ОРЗ сопровождается стойким и значительным повышением температуры тела, что сопровождается нарушением микроциркуляции, нарушением обмена веществ и нарастающим нарушением функции жизненно важных органов. В ситуации, когда у пациента острое респираторное заболевание без температуры, следует задуматься о наличии у человека иммунодефицитного состояния.
В ситуации, когда человеку, страдающему острым респираторным заболеванием, необходимо понизить температуру тела, следует соблюдать правила лечения лихорадки. Итак, не стоит быстро снижать температуру тела, а достаточно понизить ее на несколько градусов. Жаропонижающие таблетки от ОРЗ назначают только при необходимости и ни в коем случае не применяются систематически.
К абсолютным показаниям к применению жаропонижающих средств относятся: значительная лихорадка, наличие судорожной реакции на повышение температуры тела в анамнезе, наличие тяжелой сопутствующей соматической патологии, возраст пациента моложе трех месяцев.
Кашель с ОРЗ
Основным признаком поражения дыхательных путей при ОРЗ является кашель. Возникновение кашля у больных ОРИ связано с повреждающим действием возбудителей этого заболевания на эпителиальные клетки, выстилающие все слизистые оболочки верхних и нижних дыхательных путей. Эпителий верхних дыхательных путей является преимущественной локализацией репликации вируса, сопровождающейся разрушением эпителиоцита и распространением вирусных частиц на другие участки слизистой оболочки, а также попаданием вирионов в циркулирующую кровь.
Распространение патологического процесса при ОРЗ происходит сверху вниз, то есть в первую очередь поражаются верхние дыхательные пути, а при распространении инфекции поражаются слизистые оболочки трахеи и бронхов разного калибра.Появление кашля возникает в результате раздражения рецепторов кашля, которые расположены на слизистых оболочках, и в начальной стадии кашель носит сухой изнуряющий характер.
В организме человека возникновение кашля следует рассматривать как один из защитных механизмов, направленных на освобождение дыхательных путей и обеспечение нормальной дыхательной функции легких. При ОРЗ наблюдается иная ситуация: в дыхательных путях по-прежнему нет содержимого, которое должно выделяться из дыхательных путей, а пораженные эпителиоциты слизистых оболочек не способны препятствовать току воздуха. С капельками слизи, которые содержат вирусы мелкой фракции, возбудитель ОРЗ попадает в окружающую среду, после чего попадает в чувствительный организм.
При ОРИ, патологические изменения которых локализуются в гортани и трахее, возникает малоэффективный кашель, способствующий обострению воспалительных процессов, раздражающих слизистые оболочки гортани, мешающих ее выздоровлению. Часто у пациента, страдающего острым респираторным заболеванием, кашель может сопровождаться рвотным рефлексом, который возникает из-за близости центра кашля и рвоты в продолговатом мозге.
В ситуации, когда кашель при ОРЗ вызывает сильную боль в груди, следует учитывать наличие сухого плеврита, требующего определенной коррекции.
ОРИ у грудного ребенка часто сопровождается выраженным бронхообструктивным синдромом, вызванным нарушением проходимости бронхов, проявляющимся сухим или влажным кашлем с сопутствующими хрипами и шумом на высоте выдоха. Это состояние требует немедленной медицинской коррекции, так как впоследствии у ребенка могут развиться тяжелые осложнения острого респираторного заболевания.
ОРИ при беременности
Во время беременности каждая женщина стремится защитить себя от людей, страдающих острым респираторным заболеванием, но не во всех ситуациях это возможно. Появление яркой клинической картины ОРЗ при беременности чаще всего происходит в результате снижения функции иммунного аппарата, что является физиологическим состоянием на данный период.
Наиболее опасным для негативного воздействия на организм будущей матери и развития плода является ОРЗ вирусной этиологии, а степень риска развития осложнений напрямую зависит от срока беременности, на которой вирус был инфицирован.
ОРИ на ранних сроках беременности наиболее опасен, так как в этот период ребенок еще не получил достаточного количества материнских антител, а вредное воздействие вируса на ребенка заключается в повышении риска развития различных пороков развития. , что в некоторых ситуациях может спровоцировать развитие выкидыша.
На более поздних сроках беременности плод защищен плацентой, которая действует как механический барьер, предотвращая проникновение большинства патогенов ОРИ. Однако существует ряд патологических изменений фетоплацентарного барьера, наблюдаемых при таких состояниях, как гестоз, угроза прерывания беременности, обострение хронических соматических заболеваний, в результате которых вирусные частицы попадают в околоплодные воды и провоцируют воспалительные изменения.
На ранних сроках беременности происходит формирование и формирование структур центральной нервной системы, поэтому при ОРЗ в этот период у ребенка могут развиваться грубые пороки развития головного и спинного мозга, несовместимые с жизнью. .Кроме того, воспалительные изменения околоплодных вод провоцируют развитие трофических изменений у плода с последующим отставанием физического развития ребенка.
Развитие ОРЗ у беременной на поздних стадиях грозит образованием у ребенка признаков внутриутробной гипоксии, проявляющейся вялостью, бледностью кожных покровов, нарушением дыхания, слабостью рефлексов. Внутриутробная гипоксия — это стрессовая ситуация для новорожденного, требующая срочной медицинской коррекции.
К счастью, в большинстве ситуаций женщины, перенесшие ОРИ во время беременности, рожают здоровых детей, однако следует учитывать некоторые особенности лечения этой категории пациенток. Беременной на ранних стадиях ОРЗ категорически противопоказано употребление антибактериальных препаратов, аспиринсодержащих препаратов, согревающих процедур в виде горячих ванн. Ни в коем случае нельзя применять спиртовые компрессы и втирания, которые способствуют усугублению течения интоксикационного синдрома при ОРЗ.
Насморк при ОРЗ во время беременности не является поводом для применения сосудосуживающих капель, следует отдавать предпочтение солевым растворам типа Аквамарис, Салина. В качестве жаропонижающих средств при ОРЗ при беременности предпочтительно применять Парацетамол только при значительном повышении температуры тела.
Для улучшения трофического роста плода следует расширить рацион будущей мамы, который должен быть насыщен витаминами, кисломолочными продуктами. Кроме того, не следует забывать о расширении питьевого режима, поскольку достаточный прием и выведение воды способствует скорейшему снижению синдрома интоксикации.
Диагностика острых респираторных заболеваний
В последние десятилетия были достигнуты значительные результаты в области лабораторной идентификации возбудителей острых респираторных заболеваний, хотя не каждое медицинское учреждение оснащено оборудованием такого уровня. Определение вирусной или бактериальной природы заболевания имеет принципиальное значение для постановки точного диагноза человеку с проявлениями инфекции дыхательных путей.
Ранняя проверка диагноза «острое респираторное заболевание» происходит исключительно на основании имеющейся у пациента клинической картины.Существуют патогномоничные клинические признаки, отличающие одну этиопатогенетическую форму ОРИ от другой. Например, только для гриппа характерно наиболее резкое начало и быстрое нарастание клинических симптомов. Для других этиопатогенетических форм острых респираторных заболеваний характерно постепенное наступление клинической картины и усиление патологических изменений на третьи сутки заболевания.
Помимо учета клинических проявлений острого респираторного заболевания, лабораторная идентификация возбудителя является существенным подспорьем в диагностике данной патологии, а именно в определении этиопатогенетического фактора развития ОРИ.Современные лабораторные центры оснащены оборудованием для проведения иммунофлуоресцентной экспресс-диагностики возбудителя ОРЗ — особого цвета мазка, взятого из носовой полости пациента с использованием специфической флуоресцентной сыворотки, после чего техник исследует подготовили мазок под люминесцентным микроскопом. Продолжительность этого метода диагностики составляет не более трех часов, поэтому иммунофлуоресцентный метод считается экспресс-диагностикой ЭПР.
Более точным методом диагностики, позволяющим определить специфичность возбудителя ОРИ, является проведение серологического теста.Единственным недостатком этого лабораторного исследования является то, что оно трудоемко в выполнении и требует длительного времени до 12 дней. Определение возбудителя происходит методом оценки нарастания титра защитных антител, которые вырабатываются на протяжении всего течения болезни и уменьшаются в период реконвалесценции, поэтому серологический анализ относится к ретроспективным методам исследования.
Косвенное диагностическое значение при ОРЗ имеют некоторые биохимические показатели крови.Таким образом, при выраженном синдроме интоксикации наблюдается повышение индекса активности лактатдегидрогеназы с одновременным снижением активности холинэстеразы.
Лечение острых респираторных заболеваний
Для лечения пациентов, страдающих любой этиопатогенетической формой ОРИ, применяются лечебные, организационные, гигиенические мероприятия, действие которых направлено на выделение носителя возбудителей, снижение активности процессов размножения возбудителей в организме, стимулирование индивидуума. защитные возможности пациента, а также купирование основных симптомов болезни.
При тяжелом осложненном течении острого респираторного заболевания в обязательном порядке проводится лечение в стационаре инфекционного или пульмонологического профиля. Показано, что во время лихорадки пациенту следует соблюдать постельный режим, расширять режимы питания и питья, обогащать меню молочными продуктами и витаминами, употреблять повышенное количество жидкости. С точки зрения соблюдения требований гигиены обязательна не только регулярная чистка носовой и ротовой полости, рук, но и соблюдение гигиены кишечника.Лица, ухаживающие за больным ОРИ, должны в обязательном порядке применять барьерные методы защиты в виде ватно-марлевых повязок и оксолиновой мази.
Медикаментозное лечение неосложненной формы ОРЗ предполагает назначение этиотропной, дезинтоксикационной и симптоматической терапии. Итак, в первые 24 часа заболевания целесообразно назначать пациенту пероральную форму Ремантадина в средней суточной дозе 150 мг в течение не менее трех дней. В качестве компонента противовирусной терапии также используется лейкоцитарный интерферон, для приготовления которого необходимо порошок растворить в дистиллированной воде и закапывать в нос по 3 капли каждые два часа в течение трех дней.В ситуации, когда ринит пациента связан с тяжелым носовым дыханием при ОРЗ, любые сосудосуживающие капли необходимо закапать в каждый носовой ход перед применением интраназального интерферона.
В качестве симптоматической терапии при ОРЗ используются средства различных фармакологических категорий. Чтобы купировать боли в голове, мышцах, а также уменьшить воспаление, желательно использовать препараты из группы нестероидных противовоспалительных средств, таких как Нимид и Аспирин, которые крайне нежелательны для детей.Лучшим жаропонижающим средством при ОРЗ считается Парацетамол и его аналоги. В ситуации, когда лихорадка при ОРЗ сопровождается нарушением сна, повышенной возбудимостью, допускается применение седативных средств типа Люминала. В качестве симптоматического средства от кашля при ОРЗ используются кодеинсодержащие препараты, отхаркивающие средства, ингаляции с растворами щелочей. Во избежание сердечно-сосудистых осложнений, которые часто сопровождают течение ОРЗ, желательно назначать курс Кордиамина 30 капель трижды в день.
Антибиотики при ОРЗ с первого дня заболевания следует назначать пациентам пожилого возраста, а также лицам, страдающим иммунодефицитом, причем предпочтение следует отдавать антибактериальным средствам широкого спектра действия. В качестве дезинтоксикационной терапии не всегда следует использовать лекарства, но их достаточно для увеличения количества выпиваемой жидкости. При тяжелом течении ОРВИ необходима парентеральная регидратация с применением солевых и коллоидных растворов.
Лечение больных с гипертоксической формой ОРЗ требует расширения медикаментозной терапии в условиях стационара в отделении интенсивной терапии.ОРЗ вирусной этиологии устраняют методом многократного введения противовирусного гамма-глобулина в разовой дозе 3 мл с кратностью приема каждые 6 часов. Бактериальная токсемия при ОРЗ является основанием для парентерального введения морфоциклина или большой дозы пенициллина, до 2 000 000 единиц.
Таким образом, современные препараты применяются при лечении ОРЗ не только в короткие сроки, чтобы облегчить состояние пациента, но и предотвратить тяжелые осложнения ОРИ.
Лекарства и препараты при ОРИ
Самым основным компонентом медикаментозной терапии ОРИ являются противовирусные препараты. Препаратами первого поколения с доказанной противовирусной активностью целесообразно лечить пациентов с ОРИ, вызванными вирусом гриппа А, однако препараты этой фармакологической группы провоцируют ряд серьезных побочных реакций, ограничивающих их применение.
В последнее время для лечения острых респираторных инфекций используются препараты второго поколения, которые представляют собой ингибиторы нейраминидазы в интраназальной форме (Реленза) или перорально (Тамифлю).Чтобы оценить эффективность этих препаратов, было посвящено большое количество рандомизированных исследований, и их противовирусная эффективность составила более 90%.
Единственным недостатком противовирусных препаратов является их вирусоспецифичность, то есть узкий спектр эффективности и образование устойчивых вирусов, снижающих их положительный эффект. При благоприятной эпидемиологической ситуации препараты противовирусного действия использовать нецелесообразно, так как в общей структуре заболеваемости ОРЗ этиология гриппа составляет не более 10%.
Антибиотики при ОРЗ назначают при достоверной бактериальной этиологии заболевания, а также развитии бактериальных осложнений в виде пневмонии, отита, синусита, инфекций мочевыводящих путей. Основная ошибка большинства врачей общей практики — профилактическое применение антибиотиков при всех формах ОРЗ, провоцирующих у пациента устойчивость к антибиотикам.
Симптоматические препараты следует включать в обязательную схему лечения пациентов с любой формой ОРИ, поскольку широкий спектр этих препаратов позволяет существенно облегчить состояние пациента.В последнее время фармацевтические компании начали активно разрабатывать комбинированные симптоматические препараты, содержащие несколько активных компонентов, действие которых направлено на купирование тяжелых клинических проявлений, отягчающих течение ОРЗ. Еще одно преимущество комбинированных симптоматических препаратов состоит в том, что при их приеме риск передозировки минимален. Основным компонентом комбинированных симптоматических препаратов являются жаропонижающие Парацетамол или Ибупрофен, поэтому эти препараты противопоказаны для лечения детей до 15 лет, так как могут спровоцировать развитие синдрома Рея в виде энцефалопатии и острой жировой болезни печени. исход которого — печеночная недостаточность.
По отношению к высокой жаропонижающей активности и при этом минимальному негативному воздействию на организм пациента Парацетамол является лучшим препаратом для купирования лихорадки при ОРЗ у ребенка. Обезболивающее действие Парацетамола обусловлено периферической блокировкой импульсов на хеморецепторах, провоцирующих развитие болевого синдрома. Таким образом, действие Парацетамола ограничивается воздействием на центры терморегуляции, расположенные в гипоталамусе.
Еще одним компонентом в производстве комбинированных препаратов является блокатор h2-гистаминовых рецепторов Фенирамин, основное действие которого — потенцирование антиэкссудативного действия стимуляторов альфа-1-адренорецепторов.Кроме того, Фенирамин оказывает седативное действие, а также может приводить к сонливости, в связи с чем препараты, содержащие этот компонент, нежелательно принимать пациентам, деятельность которых связана с повышенным вниманием и быстрой реакцией.
С целью устранения немотивированной слабости, а также улучшения работоспособности пациентов, страдающих острым респираторным заболеванием, фармакологи включают кофеин в качестве компонента комбинированных симптоматических средств, которые могут вызывать гипертонический эффект, и поэтому его следует ограничивать пациентам с ОРЗ страдает гипертонией.
Обязательным компонентом комбинированных симптоматических препаратов, применяемых при лечении острых респираторных заболеваний, является аскорбиновая кислота, повышающая выработку эндогенного интерферона, способствующая нормализации процессов перекисного окисления липидов, снижающая проницаемость стенок сосудов. При ОРЗ у пациента повышенная потребность в витамине С, запасы которого можно пополнить приемом аскорбиновой кислоты.
Выбор комплексного препарата при лечении острых респираторных заболеваний должен строго дифференцироваться, исходя из клинической картины заболевания, уровня безопасности, наличия сопутствующих соматических заболеваний.Преимущества комбинированных симптоматических препаратов заключаются в том, что они быстро купируют клинические проявления ОРЗ, содержат минимальные дозировки действующих веществ, исключающих их передозировку, удобны и экономичны в применении, быстро и эффективно улучшают качество жизни пациентов, страдающих острым респираторным заболеванием в условиях острый период.
? ОРЗ — какой врач поможет? При наличии или подозрении на развитие ОРИ следует немедленно обратиться за консультацией к таким врачам, как терапевт, инфекционист.
Состав липосом оризалина (ORZ): исследования in vitro и судьба in vivo
Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
Списки содержания доступны на сайте SciVerse ScienceDirect
Домашняя страница журнала Европейского журнала фармацевтики и биофармацевтики: www.elsevier.com/locate/ejpb
Научная статья
Состав оризалина ( ORZ) липосомы: исследования in vitro и судьба in vivo Руи М. Лопес а, М. Луиза Корво а, Карла В.Eleutério a, Manuela C. Carvalheiro a, Ef e Scoulica b, M. Eugénia M. Cruz a, ab
iMed.UL — Научно-исследовательский институт лекарственных средств и фармацевтических наук, фармацевтический факультет, Лиссабонский университет, Лиссабон, Португалия Школа медицины Медицина, Лаборатория клинической бактериологии и паразитологии, Университет Крита, Ираклион, Греция
article
info
История статьи: Поступила 16 марта 2012 Принята в редакции 26 июня 2012 Доступна онлайн 5 июля 2012 Ключевые слова: Динитроанилины Оризалин Лейшманиоз Липосомы Наномеи
реферат Оризалин (ORZ) представляет собой динитроанилин, который привлекает все больший интерес для лечения лейшманиоза.Возможное использование ORZ в качестве противопаразитарного средства ограничено низкой растворимостью в воде, связанной с быстрым клиренсом in vivo. Целью этой работы было преодоление этих неблагоприятных фармацевтических ограничений, усиливающих антилейшманиозную активность ОРЗ, что позволило использовать его в будущем в клинических условиях. Это было достигнуто путем включения ORZ в соответствующие липосомы, которые действуют одновременно как растворитель лекарственного средства и носитель, доставляющий ORZ к участкам инфекции Leishmania. Разработанные липосомальные препараты ORZ эффективно включали и стабилизировали ORZ, увеличивая его концентрацию в водных суспензиях, по крайней мере, в 150 раз без использования токсичных растворителей.Включение ORZ в липосомы снижало гемолитическую активность и цитотоксичность in vitro, наблюдаемые для свободного лекарственного средства, в то время как ORZ проявляет стабильную связь с липосомами в течение первых 24 часов после парентерального введения, значительно снижая клиренс ORZ из крови и выведение из организма. Одновременно наблюдалась повышенная доставка ОРЗ в основные органы лейшманиальной инфекции с накоплением в 9–13 раз выше, чем у свободных ОРЗ. Эти результаты подтверждают идею о том, что эффективность ORZ была значительно улучшена за счет включения в липосомы.Более того, липосомальные композиции ORZ можно вводить in vivo в водных суспензиях без необходимости использования токсичных растворителей. Ожидается улучшение терапевтической активности липосомального ОРЗ, что будет проверено в будущих исследованиях. Ó 2012 Elsevier B.V. Все права защищены.
1. Введение Лейшманиоз — это заболевание, вызываемое более чем 20 различными видами и подвидами простейших паразитов рода Leishmania, которым страдают около 12 миллионов человек во всем мире [1]. Передача этого заболевания происходит через гематофаги-переносчики, и, в зависимости от возбудителя, лейшманиоз человека может проявляться как кожная (CL), слизисто-кожная (MCL) или висцеральная (VL) формы, при отсутствии лечения VL фатален [2,3].Хотя преобладает в тропических странах и
Сокращения: CL, кожный лейшманиоз; MCL, кожно-слизистый лейшманиоз; ВЛ, висцеральный лейшманиоз; ТФЛ, Трифуралин; ОРЗ, Оризалин; DPPC, дипальмитоилфосфатидилхолин; DPPG, дипальмитоилфосфатидилглицерин; DMPC, димиристоилфосфатидилхолинель; DMPG, димиристоилфосфоглицерин; FBS, фетальная бычья сыворотка; THP-1, линия моноцитарных клеток человека; I.E., эффективность включения; L.C., грузоподъемность; Ø, средний диаметр; PI — индекс полидисперсности; f — дзета-потенциал; TFA, трифторуксусная кислота; Эритроциты, эритроциты; Tt — температуры фазовых переходов; Lip-14C-ORZ, ORZ– липосомы, меченные 14C; 3H-Lip, ассоциированные с холестерином липосомы, меченные 3H; Free-14C-ORZ, свободный ORZ, меченный 14C; % ID, процент введенной дозы.⇑ Автор, ответственный за переписку. iMed.UL — Научно-исследовательский институт лекарственных средств и фармацевтических наук, фармацевтический факультет Лиссабонского университета, Av. Проф. Гама Пинто, 1649-003 Лиссабон, Португалия. Тел .: +351 217500764. Адрес электронной почты: [электронная почта защищена] (M.E.M. Cruz). 0939-6411 / $ — см. Вводную часть Ó 2012 Elsevier B.V. Все права защищены. http://dx.doi.org/10.1016/j.ejpb.2012.06.013
субтропических регионах, лейшманиоз также эндемичен для юга Европы [4]. В Европе, Южной Америке, Азии и Африке коинфекция лейшмании и ВИЧ становится новой проблемой, о которой уже сообщалось в 35 из 88 эндемичных по ВЛ стран [5,6].На протяжении более 70 лет препаратами первой линии в большинстве стран были инъекционные пятивалентные препараты сурьмы (Pentostam® и Glucantime®). Лечение длительное, потенциально токсичное и болезненное; оно стало неэффективным в некоторых частях Индии и Непала, поскольку возникло сопротивление. К лечению второй линии относятся такие препараты, как диамидинпентамидин, паромомицин и амфотерицин B, липидные препараты амфотерицина B (AmBisome and) и первый пероральный препарат милтефозин. Однако их использование также ограничено из-за токсичности и / или длительных курсов лечения, высокой стоимости в дополнение к появлению устойчивости [7].По этим причинам существует острая потребность в новых противолейшманиозных препаратах. Динитроанилины, такие как Трифуралин (TFL) и Оризалин (ORZ), широко используются в составах гербицидов. Их гербицидный эффект обусловлен антимитотической активностью, которая, в свою очередь, определяется связыванием динитроанилинов с тубулинами, основным структурным компонентом микротрубочек [8]. Взаимодействие динитроанилинов с тубулинами чрезвычайно специфично: эти вещества эффективно связываются с тубулинами растений и простейших и практически не связываются с
282
R.M. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
тубулины животных и грибов [9]. Благодаря этой специфичности в эту группу соединений входят перспективные противопаразитарные средства с доказанной активностью против тубулина нескольких паразитических простейших, таких как Trypanosoma spp., Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii и Leishmania spp. [9–12]. Предыдущие исследования уже показали, что ORZ и TFL активны in vitro против Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania donovani и Leishmania infantum [10,13,14].Тем не менее, использование ORZ (рис. 1) в качестве противопаразитарного средства может быть ограничено его низкой растворимостью в воде (например, растворимость ORZ в воде составляет 2,5 мг / л). Этот недостаток может создать трудности при разработке рецептур: необходимость использовать органические растворители, которые могут привести к нежелательным побочным эффектам, неоднородные результаты биологических анализов, которые может быть трудно интерпретировать, и необходимость введения более высоких и, возможно, токсичных дозировок для in vivo. целей. Одна из стратегий, используемых в настоящее время для преодоления этой ситуации, — это включение лекарств в липосомы.Липосомы представляют собой синтетические везикулы на основе фосфолипидов, которые позволяют удерживать как гидрофильные, так и гидрофобные лекарственные средства. Эти системы доставки не только обеспечивают безопасную транспортировку высоких концентраций лекарства в живые организмы, но также обеспечивают возможное средство доставки лекарства к конкретным клеткам или органам. При инфекциях Leishmania специфическая направленность является следствием наблюдаемого факта, что обычные липосомы быстро удаляются из кровотока клетками системы мононуклеарных фагоцитов (MPS) после внутривенного (т.е.v.) администрация [15,16]. MPS включает макрофаги из печени, селезенки или костного мозга, которые действуют как системы облигатных клеток-хозяев для паразитов Leishmania, которые, в свою очередь, специально нацелены на обычные липосомы. Поскольку Black et al. [17] первое описание стратегической полезности i.v. Применение липосомальной пятивалентной сурьмы, применение липосом для лечения лейшманиоза было изучено для широкого ряда антилейшманиозных средств. Липосомы, содержащие современные антилейшманиальные препараты (пятивалентные сурьмы [18], паромомицин [19] и милтефозин [20]) или новые агенты (атоваквон [21], гармин [22]), показали улучшенные антилейшманиальные свойства против экспериментальных ВЛ по сравнению с бесплатными лекарствами.Преимущества использования новых составов ограничены из-за наличия устойчивых штаммов (например, пятивалентные сурьмы, милтефозин) или из-за ранней стадии исследований (например, атоваквон, гармин и паромомицин). Коммерчески доступный липосомальный амфотерицин B, AmBisome®, не только улучшил терапевтическую эффективность лекарственного средства, но также снизил его токсичность для печени и почек [23]. Этот препарат считается препаратом первого выбора для пациентов, не реагирующих на сурьму [24]. Однако стоимость такого лечения в настоящее время слишком высока для массового использования в развивающихся странах [25,26].В свете данного сценария будет интересно изучить возможности альтернативных антилейшманиозных агентов и разработать соответствующие составы [27].
Насколько нам известно, исследований по разработке липосомальных препаратов для ОРЗ не проводилось. Однако успешное применение липосом для включения динитроанилинов уже было описано в литературе для TFL. Липосомные препараты, включающие TFL, показали превосходную активность in vivo по сравнению со свободным лекарственным средством на мышиной висцеральной модели инфекции (L.donovani) [28], а также при лечении экспериментального лейшманиоза собак (L. infantum) [29], при этом стерилизация паразитов не была достигнута. Целью данной работы является разработка липосомальных форм ОРЗ, оценка их поведения in vitro, а также их фармакокинетического профиля и профиля биораспределения в перспективе их будущего применения в качестве новой антилейшманиальной терапии. 2. Материалы и методы 2.1. Материалы ORZ были закуплены у Supelco (Bellefonte, США), а чистые фосфолипиды (Dipalmitoylphosphatidylcholine — DPPC; Dipalmitoylphosphatidylglycerol — DPPG; Dimyristoylphosphatidylcholine — DMPC and Dimyristoylphosphosphoids — Dimyristoylphosphospids — Dimyristoylphosphospids) были поставлены фирмой Lipton — DMPC и Dimyristoylphosphosphoids.(Алебастр, США). Радиоактивно меченый [14C] ORZ (4-аминосульфонил-2,6-динитро-N, N-ди-н-пропиланилин-Ph-UL14 C, удельная активность: 6,5 мКи / ммоль, равномерно меченный на ароматическом кольце) был предложением от Dow AgroSciences (Индианаполис, США). Радиоактивно меченый [3H] Chol ([1a, 2a (n) -3H] холестерин, специфическая активность: 44 · 103 мКи / ммоль) был получен от Amersham Radiochemicals (Amersham, UK). Ацетонитрил (степень чистоты для ВЭЖХ) был от Merck. Среда RPMI 1640 (20 мМ HEPES), пенициллин-стрептомицин и фетальная бычья сыворотка (FBS) были приобретены у Sigma-Aldrich (США).Набор для определения жизнеспособности LIVE / DEAD был получен от Molecular Probes (Великобритания). Все остальные реагенты были аналитической чистоты. 2.2. Клеточные линии и животные Линия моноцитарных клеток человека THP-1 поддерживалась в культуре в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированного нагреванием FBS, L-глутамина, пенициллина 100 Ед / мл и стрептомицина 100 мкг / мл, pH 7,4 при 37 °. C, 5% CO2. Промастиготы L. infantum MHOM / TN / 80 / IPT1 / LEM 235 выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, L-глутамина и антибиотиков при 26 ° C. Самцы мышей CD1 массой 25–30 г были получены из Charles River, Барселона, Испания.Животных кормили стандартным лабораторным кормом и водой ad libitum. Все эксперименты на животных проводились с разрешения местного комитета по этике животных и в соответствии с Хельсинкской декларацией, Директивой EEC (86/609 / EEC) и португальскими законами D.R. нет. 31/92, D.R. 153 IA 67/92 и все следующие законодательные акты. 2.3. Приготовление липосомальных препаратов ORZ
Рис. 1. Химическая структура ORZ (3,5-динитро-N0, N0-дипропилсульфаниламид, C12h28N4O6S). ORZ представляет собой желто-оранжевое кристаллическое вещество с молекулярной массой 346.36, растворим в воде при 2,5 мг / л при pH 7/25 ° C и pKa 8,6.
Включение ORZ в липосомы осуществляли методом дегидратации-регидратации (DRV) [30,31] с некоторыми модификациями. Вкратце, соответствующие количества фосфолипидов (10 мМ) и ORZ (86,5–865 мкг / мл) растворяли в хлороформе и сушили на роторном испарителе Büchi RE-111 (Büchi, Швейцария) до образования гомогенной пленки. Пленку диспергировали в воде, и полученную суспензию замораживали и лиофилизировали в течение ночи в сублимационной сушилке Moduyo (Edwards, Германия).Лиофилизированный порошок повторно гидратировали в два этапа: сначала с использованием трегалозо-цитратного буфера (10 мМ цитрат, 135 мМ NaCl, 30 мМ трегалоза) pH 5,5 (2/10 конечного объема) с последующим легким встряхиванием и оставляли при комнатной температуре на 30 минут. Гидратация была завершена добавлением оставшегося объема (8/10 конечного объема)
рм. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
цитратный буфер (10 мМ цитрат, 145 мМ NaCl, pH 5.5). Липосомы были уменьшены в размере путем последовательной экструзии через поликарбонатные фильтры с размером пор от 0,8 до 0,1 мкм в цилиндре для экструзии объемом 10 мл (LipexBiomembranes, Канада). Невключенный ORZ отделяли от липосомальной дисперсии с помощью эксклюзионной хроматографии на колонке PD-10 (Biorad, США). При необходимости для исследований in vitro и in vivo элюированные липосомы концентрировали ультрацентрифугированием (49000 g, 1 час 30 минут) в ультрацентрифуге Beckman L8-60M (Beckman Instruments, Inc., США) и суспендировали в цитратном буфере (если не указано иное). Липосомные композиции ORZ оценивали с точки зрения эффективности включения (I.E.), нагрузочной способности (L.C.), а также ORZ и выхода липидов, определенных, как описано с помощью приведенных ниже уравнений.
I: E: ð% Þ ¼ ð½ORZf = ½LipfÞ = ð½ORZi = ½LipiÞ 100 л: C: ðg = molÞ ¼ ½ORZ = выход ORZ Lipf% Þ ¼ ð½ORZf = ½ORZiÞ 100 ½Lip Lip] f и [ORZ] f представляют концентрацию липидов и ORZ в конечных липосомных композициях, а [Lip] i и [ORZ] i представляют концентрацию липидов и ORZ в исходной липосомной суспензии.
2.4. Характеристика липосом 2.4.1. Измерения размера и дзета-потенциала. Средний диаметр (Ø) липосом и индекс полидисперсности (PI) определяли с помощью квазиупругого рассеяния лазерного света в Malvern Zetasizer 1000HSA (Malvern Instruments; Великобритания). Дзета-потенциал (поверхностный заряд f) определяли с помощью лазерной доплеровской спектроскопии в приборе Zetasizer 2000 (Malvern Instruments, Великобритания).
2.4.2. ORZ и количественное определение липидов. Содержание липосомных ORZ определяли с помощью метода ВЭЖХ. Система ВЭЖХ состояла из System Gold (Beckman Instruments, Inc., США), автоинжектор Midas Spark 1.1 и детектор Diode-Array 168 (Beckman Instruments, Inc., США). ORZ-анализ выполняли с помощью УФ-детекции при фиксированной длине волны 284 нм. Разделение ORZ и липидов и количественное определение ORZ проводили в аналитической колонке Nucleosil C18, 5 мкм (150 4,6 мм) (Supelco, США), элюируемой подвижной фазой, состоящей из ацетонитрила с 0,1 М трифторуксусной кислотой (TFA): вода с 0,1 M TFA (60:40 (об. / Об.)) При скорости потока 1 мл / мин. Образцы и стандарты готовили в подвижной фазе и загружали в колонку с помощью автоматического пробоотборника Midas типа 830 с петлей для образцов на 20 мкл.Определение фосфолипидов выполняли, как описано Rouser et al. [32], основанные на количественном определении неорганического фосфора.
2.5. Исследования стабильности. Оценку стабильности липосомных ОРЗ проводили в различных условиях: в виде суспензии при комнатной температуре и в виде замороженного осадка. В первом исследовании осадки, полученные после ультрацентрифугирования, суспендировали в цитратном буфере без трегалозы (цитрат 10 мМ / NaCl 140 мМ, pH 5,5) и выдерживали при комнатной температуре в течение 72 часов. Для последнего осадок, полученный после ультрацентрифугирования, суспендировали в трегалозо-цитратном буфере и лиофилизировали в течение ночи.Все лиофилизированные составы повторно гидратировали водой при перемешивании до исходного объема. В этих исследованиях оценку стабильности проводили по изменению отношения ORZ / липид в зависимости от времени хранения, восстановления ORZ и Ø. Все значения были определены после разделения невключенных ORZ с помощью эксклюзионной хроматографии.
283
2.6. Исследования методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Поведение липосомных композиций ORZ при фазовом переходе было выполнено на калориметре DSC Q200 (TA Instruments, DE, США).Приблизительно 10 мкл липосомальных составов (концентрация липидов около 50 мМ) точно отмеряли в алюминиевые чашки, которые герметично закрывали, а затем измеряли относительно пустой чашки для сравнения. Сковороды нагревали и термограммы регистрировали в диапазоне температур 18–30 ° C со скоростью нагрева 0,5 ° C / мин. 2.7. Анализы in vitro 2.7.1. Оценка гемолитической активности. Гемолитическую активность определяли с использованием консервированной ЭДТА периферической крови человека, согласно Esteves et al. [33].Вкратце кровь центрифугировали для удаления плазмы, а эритроциты (эритроциты) трижды промывали PBS. После заключительной промывки эритроциты распределяли по 96-луночным микропланшетам (100 мкл / лунку) и добавляли равный объем свободного или липосомного ORZ (оба разбавлены PBS в концентрациях от 500 до 6 мкМ). После инкубации при 37 ° C в течение 1 ч планшеты центрифугировали (800 g, 10 мин) и собирали супернатанты. Поглощение супернатанта измеряли при 540 нм с эталонным фильтром при 620 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (ELx800, Biotek, США).В каждый планшет добавляли лунки положительного и отрицательного контроля. Отрицательный контроль заключался в нормальном гемолизе, достигаемом инкубацией эритроцитов с PBS, а положительный контроль (100% гемолиз) состоял в инкубации с водой. Определяли также абсорбцию липосомального и свободного растворов ORZ и использовали в качестве контроля. Процент гемолитической активности каждого состава при различных концентрациях оценивали с использованием [(A A0) / (Amax A0)] 100, где A0 — гемолиз отрицательного контроля, а Amax соответствует 100% гемолизу (положительный контроль).Гемолитическую активность также оценивали путем определения значения НС50 (концентрации лекарственного средства, лизирующей 50% эритроцитов), рассчитанного с использованием сигмоидального регрессионного анализа. 2.7.2. Оценка цитотоксичности. В качестве количественного измерения повреждения клеток после инкубации с различными концентрациями липосомального и свободного ORZ использовали двойное окрашивание с помощью SYBR-14 и йодида пропидия. Клетки THP-1 (1 106 клеток / мл) инкубировали с различными концентрациями (50–0,4 мкМ) липосомального и свободного ОРЗ. После периода инкубации в течение 72 часов приблизительно 4 106 клеток были окрашены йодидом пропидия и SYBR-14 с использованием набора для определения жизнеспособности LIVE / DEAD (Molecular Probes, Нидерланды) в соответствии с рекомендациями производителя.Затем окрашенные клетки THP-1 анализировали проточной цитометрией на модельном проточном цитометре Epics Elite (Coulter, Miami, FL). Возбуждение обоих красителей производилось при 488 нм. Дифференциальный мониторинг красителей был достигнут путем считывания зеленой флуоресценции SYBR-14 при 545 нм и красной флуоресценции PI при 645 нм. На образец анализировали не менее 10 000 клеток, и каждый эксперимент по окрашиванию повторяли три раза. Анализ данных проводился по интенсивности флуоресценции, исключающей автофлуоресценцию клеток и клеточный дебрис.Цитотоксический эффект оценивали путем определения значения CC50 (концентрация лекарственного средства, которая убивает 50% клеток THP-1), рассчитанного с использованием сигмоидального регрессионного анализа. 2.7.3. Анализ чувствительности внутриклеточных амастигот к лекарственным средствам. Клетки THP-1 дифференцировали с помощью 1 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma) в течение 72 часов при 37 ° C / 5% CO2. Затем клетки дважды промывали PBS и один раз в простой среде RPMI и инкубировали в течение ночи с промастиготами L. infantum (LEM 235) при соотношении паразит / клетки 4: 1 при 37 ° C / 5% CO2. После инкубации клетки собирали, собирали в среде RPMI и осторожно наслаивали на 4 мл Histopaque 1077 (Sigma).Свободные промастиготы удаляли центрифугированием при
284
об / мин. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
1000 г в течение 20 мин. Непрозрачный клеточный слой, содержащий мононуклеарные клетки, собирали, трижды промывали PBS и один раз простым RPMI и ресуспендировали при концентрации 4 · 105 клеток / мл. Зараженную клеточную культуру высевали (200 мкл / лунку) в 24-луночные планшеты (Cellstar, Greiner) и инкубировали в течение 48 ч при 37 ° C и 5% CO2 в отсутствие или в присутствии равного объема (200 мкл). свободных ОРЗ и их липосомальных препаратов в нескольких разведениях (50–6 мкМ).После инкубации содержимое лунок фиксировали метанолом, окрашивали Геймса и наблюдали под микроскопом, чтобы определить количество инфицированных клеток в 100 подсчитанных клетках. IC50 (концентрация лекарственного средства, снижающего инфекцию на 50%) рассчитывалась с использованием сигмоидального регрессионного анализа. 2.8. Фармакокинетические исследования и исследования биораспределения 2.8.1. Сравнительное исследование: липосомный и свободный ORZ Самцов мышей CD1 массой от 25 до 30 г случайным образом разделили на группы по 5. В одну группу — 200 мкл липосомного состава ORZ (DMPC: DMPG 7: 3 (F1), 0.15 мкмоль ORZ вводили через боковую хвостовую вену мыши. Липосомный состав ORZ был приготовлен, как описано выше (см. Раздел 2.3), с использованием следов 14C-ORZ (4,1 · 106 импульсов в минуту / мл) и 3H-холестерина (1,8 · 106 импульсов в минуту / мл). Для сравнения во всех исследованиях также оценивали раствор свободного ORZ со следами 14C-ORZ (0,15 мкмоль введенного ORZ), приготовленный в Tween®80: цитратном буфере (40:60, об. / Об.). Группы из пяти животных были умерщвлены через 30 минут и через 1, 2, 4, 6 и 24 часа после введения дозы.Образцы крови собирали из орбитального синуса в пробирки с ЭДТА. Печень, селезенку, сердце, легкие и почки немедленно удаляли у животных и промывали PBS для удаления избытка крови. В выбранные моменты времени желчный пузырь удаляли, переносили в сцинтилляционный флакон и взвешивали. После полоскания органы быстро сушили, взвешивали и мелко измельчали. Затем 0,05 г пробы каждого органа и 0,05 мл крови добавляли в сцинтилляционные флаконы. Все образцы переваривали в течение ночи при 60 ° C с помощью 0.1 мл хлорной кислоты (72%) и 0,2 мл пергидрола (перекись водорода, 30%). Образцы нейтрализовали 0,1 мл уксусной кислоты и добавили 10 мл сцинтилляционной смеси. Все образцы подсчитывали на радиоактивность на сцинтилляционном счетчике Beckman LS 5000 (Beckman Instruments, Inc., США). 2.9. Статистический анализ Представленные данные выражены в виде среднего (±) и стандартного отклонения (S.D.). Статистический анализ выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Приемлемая вероятность значительного различия между средними значениями была p
.
этого препарата оценивали как функцию фосфолипидов с двумя различными температурами фазового перехода (Tt) (DMPC: DMPG, Tt = 23 ° C и DPPC: DPPG, Tt. = 42 ° C) и молярное соотношение двух липидов (7: 3 и 9: 1).Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что на включение ORZ сильно влиял липидный состав препарата. Фактически, F1 и F2 (более низкие значения Tt.) Обеспечивали составы с более высокими значениями L.C. (около 30 г / моль) по сравнению с F3 (более высокая Tt), который составляет 16 г / моль для L.C. Уменьшение молярного отношения DMPG в составе привело к снижению дзета-потенциала с 41 мВ (F1) до 19 мВ (F2), хотя это изменение поверхностного заряда не влияло на включение ORZ или размер липосом.Чтобы определить, можно ли дополнительно улучшить параметры включения, а именно, если L.C. можно было увеличить, был изучен профиль насыщения F1. Это было сделано путем оценки влияния [ORZ / Lip] i на параметры включения (рис. 2). Результаты показывают, что L.C. увеличивается с увеличением [ORZ / Lip] i, достигая плато при [ORZ / Lip] i, равном 44 г / моль. Независимо от количества ORZ, включенного в липосомы, размер липосом и дзета-потенциал не изменились. Все составы имели сильно отрицательный поверхностный заряд (ок.35 мВ) и средний размер около 0,13–0,15 мкм с PI
Таблица 1 Параметры включения для различных липосомальных составов ORZ. Липидный состав препарата
L.C.a (г / моль)
I.E. (%)
Выход липидов (%)
Выход ORZ (%)
Øb (лм)
Дзета-потенциал (мВ)
F1 F2 F3
29 ± 3 30 ± 1 16 ± 4
88 ± 4 88 ± 5 43 ± 4
89 ± 5 92 ± 4 88 ± 5
77 ± 4 81 ± 4 38 ± 5
0.14 ± 0,02 0,14 ± 0,02 0,15 ± 0,01
41 ± 3 19 ± 2 36 ± 4
DMPC: DMPG (7: 3) DMPC: DMPG (9: 1) DPPC: DPPG (7: 3)
Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение (n = 3). a [ORZ / Lip] i = 34,6 г / моль. b Для всех составов PI
R.M. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
285
F2) были выбраны для дальнейшего тестирования, такого как анализы in vitro и in vivo. 3.4. Анализы in vitro И липосомные, и свободные ORZ были оценены in vitro на их токсичность для клеток человека, на их гемолитическую активность по отношению к эритроцитам человека (RBC) и на их антилейшманиозную активность.Антилейшманиальную активность оценивали против внутриклеточной формы L. infantum. На основе данных всех этих анализов мы рассчитали различные концентрации, которые смогли снизить 50% активности клеток, и результаты представлены в таблице 2.
Рис. 2. Влияние исходного отношения ORZ / липид ([ORZ / Lip] i) от параметров включения (LC и IE). Концентрация липидов во всех составах составляет 10 мМ. I.E. (%) (h) и L.C. (г / моль) (г). Все липосомальные препараты ORZ, использованные в этом исследовании, были свежеприготовленными.Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение. (n = 3).
3.3. Термотрофное поведение липосом ORZ. Термотрофное поведение липосом (F1) с ORZ и без него было изучено с целью оценки изменений конформационных свойств фосфолипидов, вызванных включением ORZ. Соответствующие термограммы представлены на фиг. 3. Результаты показывают, что пустой F1 имеет типичную Tt при 23,5 ° C из-за перехода из гелевого состояния в жидкокристаллическое состояние составляющих липидов.Включение ORZ в эти липосомы вызвало модификацию теплового поведения, что привело к отмене наблюдаемого Tt пустого состава. Соответственно энтальпия снизилась с 34,9 до 3,49 Дж / г. Эти данные совместимы с взаимодействием ORZ с ацильными группами фосфолипидов. Из-за их высоких параметров включения и высокой стабильности, как в суспензии, так и после сублимационной сушки, а также того факта, что они не подвергаются переходной температуре во время процедур манипуляции, оба липосомальных состава DMPC: DMPG (F1 и
3.4.1. Гемолитическая активность и цитотоксичность. Оценку гемолитической активности липосом и свободных ORZ проводили с использованием эритроцитов (в качестве маркера общей мембранной токсичности), в то время как их цитотоксичность оценивали с использованием моноцитарной линии клеток THP-1 (линия макрофагоподобных клеток). Липосомальные композиции ORZ F1 и F2, а также свободное лекарственное средство испытывали одновременно. Результаты, представленные на рис. 4, показали, что оба липосомальных препарата ORZ не проявляли значительной гемолитической активности даже при более высокой тестируемой концентрации (500 мкМ), в то время как свободное лекарственное средство обладало значительной гемолитической активностью (около 20% гемолиза при 100 мкМ).Как показано на фиг. 5, свободный ORZ также имел цитотоксический эффект на клетки THP-1 (CC50 39 мкМ). Однако, когда лекарство было включено в структуру липосом, цитотоксический эффект не наблюдался при концентрациях до 50 мкМ. 3.4.2. Активность против внутриклеточной формы Leishmania infantum. Антилейшманиозную активность липосомальных композиций ORZ против внутриклеточной амастиготной формы Leishmania оценивали in vitro путем инфицирования клеток THP-1 промастиготами L. infantum (LEM 235). После обработки увеличивающимися концентрациями липосомального или свободного ОРЗ измеряли процент инфицированных клеток (рис.6). Результаты показывают, что после включения в липосомы ORZ сохранял активность против внутриклеточной формы L. infantum. Хотя результаты не показывают значительных различий между обоими липосомальными препаратами (IC50 = 16,4 мкМ), включение ORZ в липосомы немного увеличивало лекарственную активность свободной формы (IC50 = 24,2 мкМ). После включения ORZ в липосомы полученные составы имеют преимущества перед свободным лекарственным средством, а именно сниженную цитотоксичность и гемолитическую активность, а также повышенную внутриклеточную активность (Таблица 2).3.5. Анализы in vivo
Рис. 3. Термограммы DSC липидной композиции F1. F1 с ORZ (сплошная линия) и пустой F1 (пунктирная линия). Образцы (концентрация липидов около 50 мМ) регистрировали в диапазоне температур 18–30 ° C при скорости нагрева 0,5 ° C / мин. Все липосомальные препараты ORZ, использованные в этом исследовании, были свежеприготовленными.
Хотя составы F1 и F2 продемонстрировали высокое включение ORZ и аналогичные результаты in vitro, состав F1 был выбран для анализов in vivo (исследования биораспределения) из-за его высокого отрицательного поверхностного заряда, который, как было описано, способствует пассивному нацеливанию липосом на макрофаги в печени и селезенке. .Чтобы лучше понять судьбу состава F1 in vivo, был использован подход двойного мечения, который позволил проследить индивидуальную судьбу ORZ либо в свободной форме, либо в связанном с липосомами. Это двойное мечение также позволило отслеживать ORZ даже после его высвобождения из липосом и одновременно отслеживать судьбу только липосом. С этой целью был приготовлен F1, используя одновременно следы ORZ, однородно меченные 14C, и следы ассоциированного холестерина-липида, меченные 3H. Липосомный препарат F1 с двойной радиоактивной меткой ORZ будет обозначаться как Lip-14C-ORZ или 3H-Lip, если за составом следовали измерения 14C или 3H, соответственно.Для сравнения, во всех исследованиях также оценивали свободный ORZ (далее обозначаемый как Free-14C-ORZ).
286
Р.М. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
Таблица 2 Биологическая оценка липосомных и свободных ОРЗ in vitro. Состав
% Гемолиз при 100 мкМ / 500 мкМ
Гемолиз HC50 (мкМ)
Цитотоксичность CC50 (мкМ)
Внутриклеточный L. infantum IC50 (мкМ)
ORZ F1 F2
19.6 ± 2,5 / 54 ± 3,4 0,0 / 4,8 ± 1,1 0,0 / 6,1 ± 1,2
425 ± 10> 500> 500
39 ± 4> 50> 50
24,2 16,4 16,4
Концентрация ДМСО
Рис.4. Гемолитическая активность, индуцированная липосомными и свободными ОРЗ. Эритроциты подвергались воздействию различных концентраций лиофилизированного восстановленного липосомного состава F1 (j), F2 (N) и свободного ORZ (O). Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение. (n = 3).
Рис. 6. Противопаразитарная активность липосомных и свободных ОРЗ против линии клеток THP-1, инфицированных L.младенец. Процент инфицированных клеток THP-1 измеряли в присутствии различных концентраций лиофилизированного восстановленного липосомального состава F1 (j), F2 (N) и свободного ORZ (O). Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение. (n = 3).
Рис. 5. Цитотоксическое действие липосомальных и свободных ОРЗ в отношении линии клеток THP-1. Клетки подвергали воздействию различных концентраций лиофилизированного восстановленного липосомного состава F1 (j), F2 (N) и свободного ORZ (O). Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение. (n = 3).
Рис. 7. Профили крови липосомных и свободных ОРЗ. Здоровым мышам вводили в / в. с F1 (Lip-14C-ORZ (s) и 3H-Lip (d)) и Free-14C-ORZ (D)). Данные были выражены как процент обнаруженной введенной дозы (% ID / кровь). Свежеприготовленный F1 и свободный ORZ вводили в дозе 0,15 мкмоль / мышь. Представленные значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение, n = 5, p
3.5.1. Профиль крови: липосомный или свободный ORZ. Профиль крови двойного радиоактивно меченного F1 и Free-14C-ORZ в течение 24 часов после i.v. введение показано на фиг. 7. И липосомный, и свободный ORZ показали двухкомпонентное поведение в отношении клиренса крови. Липосомный ORZ (за которым следует Lip-14C-ORZ или 3H-Lip) быстро снижается в первые 30 минут после введения до значения 58% ID, после чего следует другое снижение наклона кривой, остающееся только 20% ID через 24 часа. Однако уровни Free-14C-ORZ в крови снижались еще быстрее:
только 17% ID через 30 минут, и только остаточные количества наблюдались в конце 24 часов.Несмотря на это быстрое снижение уровня в крови, через 4 часа после введения наблюдалось небольшое и временное повышение Free-14CORZ. Параллельное увеличение также наблюдалось для Lip-14C-ORZ; однако это произошло через 6 часов после введения. Профили клиренса, проанализированные двумя лейблами, Lip-14C-ORZ и 3H-Lip, которые измеряют уровни в крови для состава F1, были очень похожими, что свидетельствует об уменьшении утечки ORZ из
R.M. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
липосом и, следовательно, стабильности липосом.Это предположение было подтверждено постоянным соотношением Lip-14C-ORZ к 3H-Lip (% ID Lip-14CORZ /% ID 3H-Lip) в крови со значениями от 0,95 до 1,12 в течение 4 часов после введения, что указывает на то, что ORZ оставался включенным в липосомы. Небольшое уменьшение этого соотношения наблюдалось через 6-24 часа после введения, что означает, что липосомы, оставшиеся в кровотоке, начали терять часть включенного ORZ. 3.5.2. Исследования биораспределения: липосомный по сравнению со свободным ОРЗ. Распределение липосомального и свободного ОРЗ оценивалось в пяти основных органах, с особым вниманием к печени и селезенке, поскольку они являются органами, наиболее пораженными висцеральным лейшманиозом.Результаты по накоплению Lip-14C-ORZ и 3H-Lip, а также Free-14C-ORZ в печени и селезенке в течение 24 часов после в / в. введения, показаны на фиг. 8A и B соответственно. После введения F1 быстрое и одновременное накопление Lip-14C-ORZ и 3H-Lip в печени наблюдалось в течение первых 2 часов, когда обе метки достигли своих более высоких значений 14 и 18% ID / г, соответственно. Накопление в селезенке происходило по аналогичной схеме с максимальными уровнями Lip-14C-ORZ и 3H-Lip 21 и
Рис.8. Профили биораспределения липосомных и свободных ОРЗ в печени (А) и селезенке (В). Здоровым мышам вводили в / в. с F1 (Lip-14C-ORZ () и 3H-Lip (j)) и Free-14C-ORZ (h). Данные были выражены как процент обнаруженной введенной дозы на грамм органа (% ID / г органа). Свежеприготовленный F1 и свободный ORZ вводили в дозе 0,15 мкмоль / мышь. Представленные значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение, n = 5, p
287
26% ID / г, также полученное через 2 часа после введения. По истечении этого периода уровни Lip-14C-ORZ и 3H-Lip в обоих органах постепенно снижались, и через 24 часа после введения уровни обеих меток все еще составляли примерно 6 и 8% ID / г в печени и примерно 5 и 6. % ID / г в селезенке соответственно.В течение 24-часового периода уровни Lip-14C-ORZ в обоих органах были значительно выше (p 20% ID), что связано с тканью с высоким содержанием сосудов, присутствующей в легких, что может привести к большему количеству остаточной крови даже после промывания буфером. . После макроскопического исследования желчного пузыря было замечено, что в группах, которым вводили липосомный состав ORZ, орган представлял большое количество жидкостей, что позволило нам определить уровни Lip-14C-ORZ и 3H-Lip в этом орган.Во всех группах Free-14C-ORZ желчный пузырь был пуст, поэтому невозможно было измерить количество накопленных радиоактивных меток. Результаты, полученные для% ID / желчного пузыря для обоих компонентов F1 (Lip-14C-ORZ и 3H-Lip), представлены на рис. 9. Результаты показывают, что накопление обеих меток в желчном пузыре представляет две отличительные фазы. . На первой фазе, между 30 минутами и 2 часами после введения, наблюдалось увеличение как Lip-14C-ORZ, так и 3H-Lip, за которым следовала вторая фаза, когда уровни обоих компонентов F1 постепенно снижались.Эти наблюдения согласуются с данными, полученными в печени, селезенке и крови, включая феномен второго пика Lip-14CORZ через 6 часов после введения, который может быть результатом энтерогепатической циркуляции ORZ.
4. Обсуждение Лейшманиоз классифицируется ВОЗ как забытая тропическая болезнь; однако вакцины в настоящее время нет, поэтому
288
R.M. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
Таблица 3 Профиль биораспределения Lip-14C-ORZ и Free-14C-ORZ в легких, сердце и почках здоровых мышей после i.v. администрация. Время после введения 30 мин Free-14C-ORZ (% ID / г ткани) Легкие 5,3 ± 1,3 Сердце 3,7 ± 1,5 Почки 4,8 ± 2,6
1 час
2 часа
4 часа
6 часов
24 часа
Губа 14CORZ (% ID / г ткани)
Free-14CORZ (% ID / г ткани)
Lip-14CORZ (% ID / г ткани)
Free-14CORZ (% ID / г ткани)
Lip-14CORZ (% ID / г ткани)
Free-14CORZ (% ID / г ткани)
Lip-14CORZ (% ID / г ткани)
Free-14CORZ (% ID / г ткани)
Lip-14CORZ (% ID / г ткани)
Free-14CORZ (% ID / г ткани)
Lip-14CORZ (% ID / г ткани)
4.1 ± 0,7
4,6 ± 1,6
3,5 ± 0,8
3,4 ± 2,0
5,1 ± 1,1
4,9 ± 0,8
4,9 ± 0,8
0,4 ± 0,1
6,8 ± 0,6
0,3 ± 0,1
6,8 ± 1,2
2,0 ± 0,5
3,7 ± 0,7
1,7 ± 0,3
2,8 ± 1,8
1,8 ± 0,6
4,5 ± 0,8
1,5 ± 0,2
0,3 ± 0,1
2,0 ± 0,2
0,3 ± 0,1
2,0 ± 0,4
3.9 ± 0,6
3,9 ± 0,4
3,5 ± 0,5
1,9 ± 1,3
4,2 ± 0,6
5,0 ± 0,4
2,7 ± 0,6
0,5 ± 0,1
3,3 ± 0,6
0,2 ± 0,1
2,9 ± 0,7
Значения представляют собой среднее значение% ID / г органа ± стандартное отклонение, n = 5.
Химиотерапия — единственный эффективный способ лечения всех форм этого заболевания. Более того, текущая терапия либо токсична, либо теряет эффективность из-за широко распространенной резистентности штаммов Leishmania.Этот сценарий приводит к острой необходимости в новых антилейшманиозных препаратах [26,27]. Вещества, такие как динитроанилины, вызывают все больший интерес из-за специфического механизма действия (связывание тубулина с антимитотической активностью в отношении Leishmania spp.) И низкой токсичности для млекопитающих [14]. Эти факты делают динитроанилины потенциально эффективными лекарствами против Leishmania при условии, что их неблагоприятные физико-химические свойства (низкая растворимость в воде и легкая сублимация из-за низкого давления паров) преодолеваются либо химической модификацией и / или включением в системы доставки лекарств, такие как липосомы.Эта работа касалась разработки липосомальных препаратов одного динитроанилина (ORZ), которые могут улучшить эффективность лекарственного средства как in vitro, так и in vivo. Во время процесса приготовления ожидалось, что ORZ будет включен в липидный бислой липосом, а не во внутреннюю водную среду из-за его гидрофобности (растворимость в воде 2,5 мг / л и коэффициент распределения октанол / вода, log P 3,73 при pH 7) [34]. Исследования DSC подтвердили это предположение, поскольку включение ORZ устранило типичный Tt пустых липосом и сильно снизило энтальпию.Эти открытия совместимы с сильными взаимодействиями между ORZ и ацильными цепями фосфолипидов и наблюдались с другими молекулами, такими как холестерин [35] и другие гидрофобные препараты [36,37]. Соответственно, было изучено влияние изменения липидного состава липосом, а именно длины ацильной цепи, на включение ORZ. Высокие параметры включения, полученные для ORZ в составах с липидами с более низкой температурой перехода (F1 и F2), ожидались из-за более слабого взаимодействия между более короткими ацильными цепями этих фосфолипидов и, таким образом, повышенной доступности для включения ORZ.Напротив, из-за хорошо упорядоченного расположения ацильных цепей в составе F3 (более длинная цепь) ожидалась меньшая доступность для включения ORZ, что приводило к трудному встраиванию и стабилизации лекарственного средства в этих липосомах. Эти наблюдения полностью согласуются с данными, опубликованными в литературе для другого динитроанилина, TFL [29], а также для других гидрофобных препаратов, таких как рифабутин или дексаметазон [30,38]. Такое поведение подкреплялось тем фактом, что изменение поверхностного заряда препаратов (F1 по сравнению с F2) не влияло на включение ORZ, что указывает на отсутствие явных электростатических взаимодействий между лекарственным средством и головными липидными группами.Липидный состав, идентифицированный как ключевой фактор включения ORZ, также важен для стабилизации ORZ в бислое, либо в виде суспензии при комнатной температуре, либо в виде лиофилизированного осадка. Связь ORZ с ацильными цепями F1 и F2, подтвержденная исследованиями DSC, по-видимому, объясняет предотвращение утечки в течение, по крайней мере, 72 часов. Та же причина, по-видимому, подчеркивается во время процесса сублимационной сушки в присутствии криопротектора (трегалозы), чтобы избежать утечки ORZ. Аналогичный процесс билизации sta-
был описан для TFL [29], хотя для липосом ORZ требовалась более низкая концентрация трегалозы.Это различие может быть объяснено конкретными характеристиками каждого лекарства и конкретными липидными составами липосом в каждом исследовании. Стабильность липосом и их способность удерживать ORZ также была продемонстрирована in vivo с помощью двойных исследований радиоактивных меток. Фактически, постоянное соотношение между липосомами и включенным ORZ наблюдалось в крови через несколько часов после внутривенного введения. введение липосомального препарата. После оптимизации включения и стабилизации ORZ в липосомы оценивали эффективность разработанного таким образом препарата in vitro и in vivo.Включение в липосомы привело к снижению гемолитической активности и клеточной токсичности свободного ORZ. Цитотоксический эффект, наблюдаемый для свободного лекарства в клетках THP-1 (CC50 39 мкМ), вероятно, был результатом осаждения кристаллов лекарства при высоких концентрациях лекарства из-за низкой растворимости ORZ в среде для роста клеток. Этот недостаток, уже описанный для ORZ в фибробластах in vitro [11], был устранен в нашем исследовании, путем его включения в липосомы, где была получена стабильная и гомогенная суспензия.Снижение цитотоксичности ORZ для клеток THP-1 уже наблюдалось после включения ORZ в другие системы доставки лекарств, такие как твердые липидные наночастицы [39]. Относительно наблюдаемой гемолитической активности ORZ в отношении эритроцитов (HC50 425 мкМ) в литературе нет данных; однако несколько новых производных ORZ индуцировали признаки гемолиза и / или почечной дисфункции при внутривенном введении. вводили крысам [40]. Вследствие включения в липосомы все эти вредные эффекты свободных ORZ отсутствовали (HC50> 500 мкМ; CC50> 50 мкМ), что демонстрирует защитную роль липосом и возможность введения этого препарата без вредных эффектов.Подобная защитная роль липосом уже описана для нескольких классов препаратов, включая противоопухолевые (винкристин и кантаридин) [41,42], бактерицидные (рифампицин) [43] и противогрибковые (нистатин) [44]. Было доказано, что включение в липосомы нескольких современных препаратов против лейшманиоза (амфотерицин B или милтефозин) имеет решающее значение для снижения их цитотоксических или гемолитических эффектов [45,46]. Сохранение терапевтической активности было еще одним решающим фактором, который необходимо было оценить для оценки предполагаемой валидности этой композиции в качестве терапевтического агента.Поскольку промастиготы не являются клинически значимой формой паразита, более реалистичная оценка внутриклеточной формы была проведена в линии макрофагоподобных клеток (THP-1), инфицированной амастиготами L.infantum. Из этих экспериментов мы могли сделать вывод, что ORZ сохраняет свою внутриклеточную активность даже при включении в липосомы. Несмотря на признанную терапевтическую пользу использования динитроанилинов против лейшманиоза, имеется лишь несколько сообщений о фармакокинетике и биораспределении динитроанилинов после парентерального введения, и ни одно из них не связано с липосомами или другими системами доставки лекарств [47, 48].Поведение наших липосомных препаратов ORZ in vivo также оценивалось в настоящем документе
R.M. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
289
Описанные таким образом свойства липосомальной композиции ORZ, как in vitro, так и in vivo, указывают на повышение эффективности ORZ и желательно провести дальнейшие испытания. для оценки их терапевтического интереса в качестве антилейшманиозных средств. 5. Заключение
Рис.9. Профиль биораспределения F1 в желчном пузыре. Здоровым мышам вводили в / в. с F1 (Lip-14C-ORZ () и 3H-Lip (j)). Данные выражали в% ID / г органа. Свежеприготовленный F1 вводили в дозе ORZ 0,15 мкмоль / мышь. Представленные значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение, n = 5.
Липосомные композиции, содержащие ORZ, были оптимизированы путем выбора подходящего метода приготовления, липидного состава и условий эксперимента. Эти составы стабильны в различных условиях хранения и продемонстрировали превосходные биофармацевтические свойства по сравнению со свободным ORZ.Включение ORZ в липосомы оказалось важным для снижения гемолиза красных кровяных телец и цитотоксической активности клеток THP-1, наблюдаемой для свободных ORZ, и что они активны против внутриклеточной лейшманиальной инфекции. Исследования in vivo продемонстрировали эффективность липосомальной композиции в пассивном нацеливании ОРЗ на основной орган лейшманиозных инфекций (печень и селезенку). Эти результаты, по-видимому, указывают на то, что липосомы ORZ могут быть кандидатами в качестве терапевтических агентов против лейшманиоза.Для подтверждения этой гипотезы необходимы дальнейшие исследования на животных моделях лейшманиоза. Благодарности
работа. Было продемонстрировано, что липосомы ORZ имеют большое преимущество по сравнению со свободным лекарственным средством с точки зрения профиля крови и биораспределения, значительно увеличивая накопление ORZ в основных пораженных органах при лейшманиозе. Фактически было продемонстрировано, что через 2 часа после введения липосомный ORZ значительно накапливался в печени и селезенке (уровни в 9 и 13 раз выше) по сравнению со свободным лекарственным средством.Это повышенное накопление было связано с хорошо описанным механизмом обычного захвата липосом клетками MPS, которые в основном присутствуют в печени (клетки Куппфера) и селезенке [49]. Превосходство липосомальной композиции в нацеливании на ORZ наблюдалось в течение 24-часового периода оценки. Это ясно демонстрирует, что включение ORZ в липосомы не только увеличивает накопление лекарственного средства в органах-мишенях, но также позволяет ORZ оставаться в этих органах в течение более длительного периода времени, что может оказаться полезным для лечения лейшманиоза.Более того, включение ORZ в липосомы снижает быстрое выведение препарата из организма. Действительно, в то время как для свободного ORZ 85% ID было удалено из кровотока через 30 минут после введения, и только 13% ID было обнаружено во всех органах, для Lip-14C-ORZ из 45% ID, удаленного из кровотока, 34% ID были обнаружены в все органы. Более важно то, что 30% из них накапливались в печени и селезенке. Эти различия могут возникать из-за быстрого выведения свободных ОРЗ из организма или накопления в других тканях или органах.Быстрое выведение другого динитроанилина, TFL, уже наблюдалось после перорального приема с высоким накоплением в фекалиях и моче [50]. Другое исследование также продемонстрировало высокое накопление TFL в жире после внутрибрюшинного и внутримышечного введения [51]. Важным аспектом этого исследования было наблюдение второго пика ORZ в крови, который мог быть признаком того, что это лекарство реабсорбировалось в кровоток. Этот второй пиковый феномен можно объяснить обратным потоком ОРЗ в кровоток из другого органа / ткани (возможно, из жировой ткани) или энтерогепатической рециркуляцией.Хотя накопление ORZ в жире не оценивалось, наблюдаемое накопление Lip-14C-ORZ (а также 3H-Lip) в желчном пузыре могло усилить энтерогепатическую рециркуляцию. Это важный метаболический путь для многих гидрофобных соединений, о котором ранее сообщалось для нескольких динитроанилинов, включая TFL [50]. Феномен второго пика позволяет ORZ (или возможному производному) более длительное время циркулировать в крови, тем самым увеличивая его накопление в печени и селезенке, что может способствовать повышению терапевтической эффективности ORZ.
Авторы благодарят проф. Хосе Мораиш и Антониу Х. Алмейда с фармацевтического факультета Лиссабонского университета за плодотворные обсуждения и рецензирование рукописи. Мы благодарим доктора Александру Эстевес за постоянные обсуждения и помощь с графической работой. Мы благодарим компанию Dow AgroSciences за любезное предложение 14C-ORZ. Эта работа была поддержана Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Португалия и FEDER: Project PTDC / CVT / 098290/2008 и PhD Grant SFRH / BD / 44218/2008 (Р.Лопес). Литература [1] П. Дежо, Увеличение факторов риска лейшманиоза во всем мире, Пер. Рой. Soc. Троп. Med. Hyg. 95 (2001) 239–243. [2] Ф. Чаппуис, С. Сундар, А. Хайлу, Х. Галиб, С. Риджал, Р. У. Пилинг, Дж. Алвар, М. Боэларт, Висцеральный лейшманиоз: каковы потребности в диагностике, лечении и контроле?, Nat Rev. Microbiol. 5 (2007) 873–882. [3] C.V. Дэвид, Н. Крафт, Кожный и слизисто-кожный лейшманиоз, Dermatol. Ther. 22 (2009) 491–502. [4] J.C. Dujardin, Распространение трансмиссивных болезней и игнорирование лейшманиоза, Европа, Emerg.Заразить. Dis. 14 (2008) 1013–1018. [5] P. Desjeux, J. Alvar, Сопутствующие инфекции Leishmania / ВИЧ: эпидемиология в Европе, Ann. Троп. Med. Паразитол. 97 (Дополнение 1) (2003) 3–15. [6] Дж. Альвар, П. Апарисио, А. Асеффа, М. Ден Боер, К. Канявате, Ж.-П. Дедет, Л. Грандони, Р. Хорст, Р. Лопес-Велес, Дж. Морено, Взаимосвязь между лейшманиозом и СПИДом: вторые 10 лет, Clin. Microbiol. Ред. 21 (2008) 334–359. [7] Л. Монзоте, Современное лечение лейшманиоза: обзор, Antimicrob. Агенты Дж. (2009) 9–19.[8] Н.С. Морриссетт, А. Митра, Д. Септ, Л.Д. Сибли, Динитроанилины связывают альфатубулин, разрушая микротрубочки, Мол. Биол. Клетка. 15 (2004) 1960–1968. [9] Ю.М. Трауб-Чеко, Дж.М. Рамальо-Ортигао, П. Дантас, С.Л. де Кастро, H.S. Барбоза, К. Даунинг, Динитроанилиновые гербициды против простейших паразитов: случай Trypanosomacruzi, Trends Parasitol. 17 (2001) 136–141. [10] А. Армсон, С.В. Камау, Ф. Гримм, Дж. Рейнольдсон, В. Бест, Л. М. Макдональд, R.C.A. Томпсон, Сравнение эффектов бензимидазола и динитроанилинов против Leishmania infantum, Acta Trop.73 (1999) 303–311. [11] T.J. Стоккерманс, Дж.Д. Шварцман, К. Кинан, Н.С. Морриссетт, Л. Тилни, Д.С.Роос, Ингибирование репликации Toxoplasma gondii динитроанилиновыми гербицидами, Exp. Паразитол. 84 (1996) 355–370. [12] B.J. Fennell, J.A. Нотон, Э. Демпси, А. Белл, Клеточные и молекулярные действия динитроанилиновых и фосфоротиоамидатных гербицидов на Plasmodium falciparum: тубулин как специфическая противомалярийная мишень, Mol. Biochem. Паразитол. 145 (2006) 226–238. [13] Дж. Бхаттачарья, М.М.Салем, К.А. Werbovetz, Антилейшманиальные динитроанилинсульфонамиды с активностью против тубулина паразитов, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) 2395–2398. [14] М.М. Чан, Д. Фонг, Ингибирование лейшманиозов, но не макрофагов-хозяев антитубулиновым гербицидом трифуралином, Science 249 (1990) 924–926. [15] К. Келли, К. Джеффрис, С.-А. Cryan, Направленная липосомная доставка лекарств к моноцитам и макрофагам, J. Drug Deliv. (2011) 1–11.
290
Р.М. Lopes et al. / Европейский журнал фармацевтики и биофармацевтики 82 (2012) 281–290
[16] М.М. Гаспар, А. Круз, А. Ф. Пенья, Дж. Реймао, А. С. Соуза, C.V. Eleutério, S.A. Domingues, A.G. Fraga, A. Longatto Filho, M.E.M. Cruz, J. Pedrosa, Рифабутин, инкапсулированный в липосомы, проявляет повышенную терапевтическую активность на модели диссеминированного туберкулеза, Int. J. Antimicrob. Агенты 31 (2008) 37–45. [17] C.D. Блэк, Г.Дж. Уотсон, Р.Дж. Ward, Использование липосом Pentostam в химиотерапии экспериментального лейшманиоза, Пер. Рой. Soc. Троп. Med. Hyg. 71 (1977) 550–552. [18] Д.А. Скеттини, А.П. Коста Вал, Л. Ф. Соуза, К. Демичели, О. Г. Ф. Роча, М. Мело, M.S.M. Michalick, F. Frézard, Распространение инкапсулированной в липосомы сурьмы у собак, Braz. J. Med. Биол. Res. 36 (2003) 269–272. [19] Дж. Карнейро, D.C.M. Сантос, М. Оливейра, А.П. Фернандес, Л.С. Феррейра, Г.А. Рамальдес, Э.А. Нунан, Л.А. Феррейра, Местная доставка и антилейшманиальная активность in vivo липосом, нагруженных паромомицином, для лечения кожного лейшманиоза, J. Liposome Res. 20 (1) (2010) 16–23. [20] А. Папагианнарос, К.Борис, К. Демецос, П.М. Люазо, Антилейшманиозная и трипаноцидная активность новых липосомальных препаратов милтефозина, Biomed. Фармакотер. 59 (2005) 545–550. [21] E. Cauchetier, M. Paul, D. Rivollet, H. Fessi, A. Astier, M. Deniau, Терапевтическая оценка свободного и инкапсулированного в липосомы атоваквона при лечении лейшманиоза у мышей, Int. J. Parasit. 30 (2000) 777–783. [22] С. Лала, С. Праманик, С. Мукхопадхьяй, С. Бандйопадхьяй, М.К. Basu, Harmine: оценка его антилейшманиальных свойств в различных везикулярных системах доставки, J.Цель лекарства. 12 (2004) 165–175. [23] Дж. Дж. Торрадо, Р. Эспада, М.П. Ballesteros, S. Torrado-Santiago, Составы амфотерицина B и нацеливание на лекарства, J. Pharm. Sci. 97 (7) (2008) 2405–2425. [24] В. Ярдли, С. Крофт, Сравнение активности трех липидных препаратов амфотерицина В против экспериментального висцерального и кожного лейшманиоза, Int. J. Antimicrob. Агенты 13 (2000) 243–248. [25] А.К. Круз, Дж. де Толедо, М. Фалад, М.С. Terrão, S. Kamchonwongpaisan, D.E. Кайл, C. Uthaipibull, Текущее лечение и открытие лекарств против Leishmania spp.и Plasmodium spp .: обзор, Curr. Drug Targets 10 (3) (2009) 178–192. [26] S.L. Крофт, П. Оллиаро, Химиотерапия лейшманиоза — проблемы и возможности, Clin. Microbiol. Заразить. 17 (10) (2011) 1478–1483. [27] П. Рой, С. Дас, Р.Г. Auddy, A. Mukherjee, Биологическое нацеливание и доставка лекарств в борьбе с лейшманиозом, J. Cell Anim. Биол. 6 (6) (2012) 78–87. [28] К. Маркес, М. Карвальейру, М.А. Перейра, Ж. Хорхе, M.E.M. Круз, Г. SantosGomes, Эффективность липосомного трифлуралина в лечении экспериментального лейшманиоза собак, Ветеринар.J. 178 (2008) 133–137. [29] М. Карвалейро, Ж. Хорхе, К. Элевтерио, А. Ф. Пинхал, А. К. Соуза, Дж. Мораис, M.E.M. Круз, Липосомальные препараты Трифуралина, активные против инфекций Leishmania donovani, Eur. J. Pharm. Биофарм. 71 (2009) 292–296. [30] М.М. Гаспар, С. Невес, Ф. Портаэлс, Дж. Педроса, М.Т. Сильва, М.Е. Круз, Терапевтическая эффективность липосомального рифабутина на модели инфекции Mycobacterium avium, Antimicrob. Агенты Chemother. 44 (2000) 2424–2430. [31] М.Л. Корво, О. Боерман, У.Дж. Ойен, Дж.К. Хорхе, М.Э. Круз, Д.Дж. Crommelin, G. Storm, Подкожное введение супероксиддисмутазы, захваченной в липосомах с длинной циркуляцией: судьба in vivo и терапевтическая активность в модели воспаления, Pharm. Res. 17 (2000) 600–606. [32] Дж. Роузер, С. Фкейшер, А. Ямамото, Разделение полярных липидов с помощью двумерной затем послойной хроматографии и определение фосфолипидов с помощью анализа пятен на фосфор, Липиды 5 (1970) 494–496.
[33] M.A. Esteves, I. Fragiadaki, R. Lopes, E. Scoulica, M.E.M. Cruz, Синтез и биологическая оценка аналогов трифуралина в качестве антилейшманиозных агентов, Bioorg. Med. Chem. 18 (2010) 274–281. [34] ToxNet, Сеть токсикологических данных. (дата обращения 01.07.11). [35] W.W. Сулковски, Д. Пентак, К. Новак, А. Сулковска, Влияние температуры, содержания холестерина и pH на стабильность липосом, J. Mol. Struct. 744 (2005) 737–747. [36] T. Söderlund, J.Y. Лехтонен, П. Киннунен, Взаимодействие циклоспорина А с фосфолипидными мембранами: действие холестерина, Мол.Pharmacol. 55 (1) (1999) 32–38. [37] У. Бхардвадж, Д.Дж. Берджесс, Физико-химические свойства экструдированных и неэкструдированных липосом, содержащих гидрофобное лекарственное средство дексаметазон, Int. J. Pharm. 388 (2010) 181–189. [38] В.-А. Цотас, С. Муртас, С.Г. Антимизиарис, Дексаметазон, включающий липосомы: влияние липидной композиции на эффективность улавливания лекарств и стабильность везикул, Drug Deliv. 14 (2007) 441–445. [39] R. Lopes, C.V. Eleutério, L.M.D. Гонсалвеш, M.E.M. Круз, А.Дж. Almeida, Липидные наночастицы, содержащие оризалин, для лечения лейшманиоза, Eur.J. Pharm. Sci. 45 (4) (2012) 442–450. [40] К. Беккер, Стабильность in vitro и фармакокинетика новых антилейшманиальных соединений, диссертация с отличием, Университет штата Огайо, 2007 г. (дата обращения 01.07.11). [41] К.-К. Чанг, Д.-З. Лю, С.-Й. Lin, H.-J. Лян, W.-C. Hou, W.-J. Хуанг, С.-Х. Чанг, Ф.-М. Хо, Ю.-К. Лян, Инкапсуляция липосом снижает токсичность кантаридина, Food Chem. Toxicol. 46 (2008) 3116–3121. [42] Л.Д. Майер, М. Bally, H. Loughrey, D. Masin, P.R. Cullis, Липосомальные препараты винкристина, которые проявляют пониженную лекарственную токсичность и повышенную активность против опухолей L1210 и P388 мышей, Cancer Res.50 (1990) 575–579. [43] П. Деол, Г.К. Хуллер, Липосомы, специфичные для легких: стабильность, биораспределение и токсичность липосомных противотуберкулезных препаратов у мышей, Biochim. Биофиз. Acta 1334 (1997) 161–172. [44] Р.Т. Mehta, R.L. Hopfer, T. McQueen, R.L. Juliano, G. Lopez-Berestein, Токсичность и терапевтические эффекты инкапсулированного в липосомы нистатина при системных грибковых инфекциях у мышей, Antimicrob. Агенты Chemother. 31 (1987) 1901–1903. [45] М.В. Жукова, О.В. Романенко, В.А. Николаевич, М.А.Кисель, Гемолитические свойства милтефозина в липосомах различного липидного состава, Фарм.Chem. J. 44 (2010) 507–509. [46] М. Лараби, В. Ярдли, П.М. Луазо, М. Аппель, П. Легран, А. Гулик и др., Токсичность и антилейшманиозная активность новой стабильной липидной суспензии амфотерицина B, Антимикробный препарат. Агенты Chemother. 47 (2003) 3774–3779. [47] К. Дворакова, Р.Т. Dorr, A. Gallegos, T. McClure, G. Powis, Фармакокинетические исследования гербицида и противоопухолевого соединения оризалин на мышах, J. Chromatogr. B 696 (1997) 275–281. [48] А. Зайденберг, К. Марра, С. Виллагра, Р. Рул, Фармакокинетика трифлуралина в крови и сердечной ткани мышей, Химиотерапия 55 (2009) 327–334.[49] J. Kamps, G. Scherphof, Рецептор против нерецепторно-опосредованного клиренса липосом, Adv. Препарат Делив. Ред. 32 (1998) 81–97. [50] Ф.У. Erkorg, R.E. Менцер, Метаболизм трифуралина у крыс, J. Agric. Food Chem. 33 (1985) 1061–1070. [51] Дж. Эммерсон, Р.С. Андерсон, Метаболизм трифуралина у крыс и собак, Toxicol. Appl. Pharmacol. 9 (1966) 84–97.
J12011_Final CW-EIS Cover-V2_R1-WEB
% PDF-1.7 % 110 0 объект > / OCGs [2492 0 R 2508 0 R 2493 0 R 2506 0 R 2504 0 R 2505 0 R 2507 0 R 2509 0 R 2503 0 R 2510 0 R 2511 0 R 2495 0 R 2512 0 R 2513 0 R 2494 0 R 2496 0 R 2497 0 R 2498 0 R 2499 0 R 2500 0 R 2501 0 R 2502 0 R 2474 0 R 2473 0 R 2475 0 R 2476 0 R 2469 0 R 2464 0 R 2465 0 R 2466 0 R 2467 0 R 2468 0 R 2470 0 R 2471 0 R 2472 0 R 2447 0 R 2446 0 R 2448 0 R 2449 0 R 2440 0 R 2437 0 R 2438 0 R 2439 0 R 2441 0 R 2442 0 R 2443 0 R 2444 0 R 2445 0 R 2414 0 R 2413 0 R 2415 0 R 2416 0 R 2418 0 R 2417 0 R 2419 0 R 2420 0 R 2421 0 R 2411 0 R 2422 0 R 2404 0 R 2405 0 R 2406 0 R 2407 0 R 2408 0 R 2409 0 R 2410 0 R 2412 0 R 2389 0 R 2388 0 R 2390 0 R 2379 0 R 2383 0 R 2380 0 R 2381 0 R 2382 0 R 2384 0 R 2385 0 R 2386 0 R 2387 0 R 2364 0 R 2363 0 R 2365 0 R 2354 0 R 2358 0 R 2355 0 R 2356 0 R 2357 0 R 2359 0 R 2360 0 R 2361 0 R 2362 0 R 2323 0 R 2315 0 R 2324 0 R 2325 0 R 2313 0 R 2314 0 R 2316 0 R 2322 0 2317 0 R 2318 0 R 2320 0 R 2319 0 R 2321 0 R 2285 0 R 2281 0 R 2282 0 R 2283 0 R 2284 0 R 2286 0 R 228 0 0 R 2271 0 R 2272 0 R 2275 0 R 2273 0 R 2274 0 R 2276 0 R 2277 0 R 2278 0 R 2279 0 R 2233 0 R 2238 0 R 2234 0 R 2235 0 R 2236 0 R 2237 0 R 2239 0 R 2232 0 R 2240 0 R 2241 0 R 2225 0 R 2223 0 R 2224 0 R 2226 0 R 2227 0 R 2228 0 R 2229 0 R 2230 0 R 2231 0 R 2186 0 R 2191 0 R 2187 0 R 2188 0 R 2189 0 R 2190 0 R 2192 0 R 2185 0 R 2193 0 R 2194 0 R 2178 0 R 2176 0 R 2177 0 R 2179 0 R 2180 0 R 2181 0 R 2182 0 R 2183 0 R 2184 0 R 2148 0 R 2144 0 R 2145 0 R 2146 0 R 2147 0 R 2149 0 R 2143 0 R 2134 0 R 2135 0 R 2138 0 R 2136 0 R 2137 0 R 2139 0 R 2140 0 R 2141 0 R 2142 0 R 2097 0 R 2105 0 R 2106 0 R 2095 0 R 2096 0 R 2098 0 R 2104 0 R 2099 0 R 2100 0 R 2102 0 R 2101 0 R 2103 0 R 2056 0 R 2064 0 R 2065 0 R 2054 0 R 2055 0 R 2057 0 R 2063 0 R 2058 0 R 2059 0 R 2061 0 R 2060 0 R 2062 0 R 2033 0 R 2029 0 R 2030 0 R 2031 0 R 2032 0 R 2034 0 R 2028 0 R 2019 0 R 2020 0 R 2022 0 R 2021 0 R 2023 0 R 2024 0 R 2025 0 R 2026 0 R 2027 0 R 1997 0 R 1993 0 R 1994 0 R 1995 0 R 1996 0 R 1998 0 R 1992 0 R 1999 0 R 2000 0 R 1985 0 R 1983 0 R 1984 0 R 1986 0 R 1987 0 R 1988 0 R 1989 0 R 1990 0 R 1991 0 R 1968 0 R 1964 0 R 1965 0 R 1966 0 R 1967 0 R 1954 0 R 1963 0 R 1955 0 R 1956 0 R 1958 0 R 1957 0 R 1959 0 R 1960 0 R 1961 0 R 1962 0 R 1917 0 R 1916 0 R 1918 0 R 1919 0 R 1921 0 R 1920 0 R 1907 0 R 1908 0 1909 0 R 1910 0 R 1911 0 R 1912 0 R 1913 0 R 1914 0 R 1915 0 R 1880 0 R 1879 0 R 1881 0 R 1870 0 R 1871 0 R 1872 0 R 1873 0 R 1874 0 R 1875 0 R 1876 0 R 1877 0 R 1878 0 R 1840 0 R 1839 0 R 1841 0 R 1842 0 R 1843 0 R 1844 0 R 1830 0 R 1831 0 R 1832 0 R 1833 0 R 1834 0 R 1835 0 R 1836 0 R 1837 0 R 1838 0 R 1795 0 R 1804 0 R 1796 0 R 1797 0 R 1799 0 R 1798 0 R 1800 0 R 1801 0 R 1802 0 R 1803 0 R 1766 0 R 1775 0 R 1767 0 R 1768 0 R 1770 0 R 1769 0 1771 0 пр 1772 0 пр 1773 0 пр 1774 0 пр 1736 0 пр 1745 0 1737 0 пр 1738 0 пр 1739 0 пр 1740 0 пр 1741 0 пр 1742 0 пр 1743 0 пр 1744 0 пр 1713 0 пр 1712 0 пр 1703 0 R 1704 0 R 1705 0 R 1706 0 R 1707 0 R 1708 0 R 1709 0 R 1710 0 R 1711 0 R 1657 0 R 1656 0 R 1658 0 R 1659 0 R 1663 0 R 1660 0 R 1661 0 R 1662 0 R 1664 0 R 1665 0 R 1647 0 R 1648 0 R 1649 0 R 1650 0 R 1651 0 R 1652 0 R 1653 0 R 1654 0 R 1655 0 R 1616 0 R 1625 0 R 1626 0 R 1627 0 R 1615 0 R 1617 0 R 1624 0 R 1618 0 R 1619 0 R 1620 0 R 1621 0 R 1622 0 R 1623 0 R 1589 0 R 1596 0 R 1586 0 R 1587 0 R 1588 0 R 1590 0 R 1595 0 R 1591 0 R 1592 0 R 1593 0 R 1594 0 R 1556 0 R 1565 0 R 1566 0 R 1567 0 R 1555 0 R 1557 0 R 1564 0 R 1558 0 R 1559 0 R 1560 0 R 1561 0 R 1562 0 R 1563 0 R 1530 0 R 1526 0 R 1527 0 R 1528 0 R 1529 0 R 1531 0 R 1525 0 R 1532 0 R 1533 0 R 1534 0 R 1535 0 R 1516 0 R 1523 0 R 1517 0 R 1518 0 R 1519 0 R 1520 0 R 1521 0 R 1522 0 R 1524 0 R 1482 0 R 1478 0 R 1479 0 R 1480 0 R 1481 0 R 1468 0 R 1477 0 R 1469 0 R 1470 0 R 1471 0 R 1472 0 R 1473 0 R 1474 0 R 1475 0 R 1476 0 R 1440 0 R 1436 0 R 1437 0 R 1438 0 R 1439 0 R 1441 0 R 1435 0 R 1442 0 R 1443 0 R 1426 0 R 1427 0 R 1432 0 R 1428 0 R 1429 0 R 1430 0 R 1431 0 R 1433 0 R 1434 0 R 1398 0 R 1406 0 R 1407 0 R 1396 0 R 1397 0 1399 0 R 1405 0 R 1400 0 R 1401 0 R 1402 0 R 1403 0 R 1404 0 R 1367 0 R 1375 0 R 1376 0 R 1365 0 R 1366 0 R 1368 0 R 1374 0 R 1369 0 R 1370 0 R 1371 0 R 1372 0 R 1373 0 R 1337 0 R 1345 0 R 1346 0 R 1335 0 R 1336 0 R 1338 0 R 1344 0 R 1339 0 R 1340 0 R 1341 0 R 1342 0 R 1343 0 R 1308 0 R 1313 0 R 1309 0 R 1310 0 R 1311 0 R 1312 0 R 1280 0 R 1287 0 R 1281 0 R 1282 0 R 1283 0 R 1284 0 R 1285 0 R 1286 0 R 1251 0 R 1258 0 R 1252 0 R 1253 0 R 1254 0 R 1255 0 R 1256 0 R 1257 0 R 1228 0 R 1235 0 R 1229 0 R 1230 0 R 1232 0 R 1231 0 R 1233 0 R 1234 0 R 1191 0 R 1198 0 R 1192 0 R 1193 0 R 1195 0 R 1194 0 R 1196 0 R 1197 0 R] >> / OpenAction 10033 0 R / StructTreeRoot 105 0 R / Тип / Каталог >> endobj 5918 0 объект > endobj 107 0 объект > поток 2016-07-07T12: 00: 05 + 10: 002016-08-01T13: 45: 51 + 10: 002016-08-01T13: 45: 51 + 10: 00Adobe Illustrator CC 2015 (Macintosh)
1JPEG256256 / 9j / 4AAQSkZJRgABAgEASABIAAD / 7QAsUGhvdG9zaG9wIDMuMAA4QklNA + 0AAAAAABAASAAAAAEA AQBIAAAAAQAB / + 4AE0Fkb2JlAGSAAAAAAQUAAgAg / 9sAhAAMCAgICAgMCAgMEAsLCxAUDg0NDhQY EhMTExIYFBIUFBQUEhQUGx4eHhsUJCcnJyckMjU1NTI7Ozs7Ozs7Ozs7AQ0LCxAOECIYGCIyKCEo MjsyMjIyOzs7Ozs7Ozs7Ozs7Ozs7OztAQEBAQDtAQEBAQEBAQEBAQEBAQEBAQEBAQED / wAARCAEA ALUDAREAAhEBAxEB / 8QBQgAAAQUBAQEBAQEAAAAAAAAAAwABAgQFBgcICQoLAQABBQEBAQEBAQAA AAAAAAABAAIDBAUGBwgJCgsQAAEEAQMCBAIFBwYIBQMMMwEAAhEDBCESMQVBUWETInGBMgYUkaGx QiMkFVLBYjM0coLRQwclklPw4fFjczUWorKDJkSTVGRFwqN0NhfSVeJl8rOEw9N14 / NGJ5SkhbSV xNTk9KW1xdXl9VZmdoaWprbG1ub2N0dXZ3eHl6e3x9fn9xEAAgIBAgQEAwQFBgcHBgI7AQACEQMh MRIEQVFhcSITBTKBkRShsUIjwVLR8DMkYuFygpJDUxVjczTxJQYWorKDByY1wtJEk1SjF2RFVTZ0 ZeLys4TD03Xj80aUpIW0lcTU5PSltcXV5fVWZnaGlqa2xtbm9ic3R1dnd4eXp7fh2 + f3 / 9oADAMB AAIRAxEAPwD0nDw8Q4lBNFf82z8xv7o8klJvseJ / oK / 8xv8AckpX2PE / 0Ff + Y3 + 5JSvseJ / OK / 8A Mb / ckpX2PE / 0Ff8AmN / uSUr7Hif6Cv8AzG / 3JKV9jxP9BX / mN / uSUr7Hif6Cv / Mb / ckpX2PE / wBB X / mN / uSUr7Hif6Cv / Mb / AHJKV9jxP9BX / mN / uSUr7Hif6Cv / ADG / 3JKV9jxP9BX / AJjf7klK + x4n + gr / AMxv9ySlfY8T / QV / 5jf7klK + x4n + gr / zG / 3JKV9jxP8AQV / 5jf7klK + x4n + gr / zG / wBySlfY 8T / QV / 5jf7klK + x4n + gr / wAxv9ySlfY8T / QV / wCY3 + 5JSvseJ / oK / wDMb / ckpC7DxPtdY9Cv + bs / Mb + 9V5JKTYf9Eo / 4tn / UhJSZJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSkl KSUhd / S6v + Ls / wCqqSUrD / olH / Fs / wCpCSkySlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpS SlJKUkpSSlJKUkpC7 + l1f8XZ / wBVUkpWH / RKP + LZ / wBSElJklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSU pJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSF39Lq / wCLs / 6qpJSsP + iUf8Wz / qQkpMkpSSlJKUkpSSlJKUkp SSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKQu / pdX / ABdn / VVJKVh / 0Sj / AItn / UhJSZJSklKS UpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUhd / S6v + Ls / 6qpJSsP8AolH / ABbP + pCSkySlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpC7 + l1f8XZ / 1VSSl Yf8ARKP + LZ / 1ISUmSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklIXf0u r / i7P + qqSUrD / olH / Fs / 6kJKTJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKU kpSSkLv6XV / xdn / VVJKVh / 0Sj / i2f9SElJklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSkl KSUpJSklKSUpJSF39Lq / 4uz / AKqpJSsP + iUf8Wz / AKkJKTJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpS SlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSkLv6XV / xdn / AFVSSlYf9Eo / 4tn / AFISUmSUpJSklKSUpJSklKSU pJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklIXf0ur / AIuz / qqklKw / 6JR / xbP + pCSkySlJKUkp SSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpC7 + l1f8AF2f9VUkpWH / RKP8Ai2f9 SElJklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSF39Lq / 4uz / qqklKw / wCiUf8AFs / 6kJKTJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSkLv6X V / xdn / VVJKVh / wBEo / 4tn / UhJSZJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJ SklKSUhd / S6v + Ls / 6qpJSsP + iUf8Wz / qQkpMkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKU kpSSlJKUkpSSlJKQu / pdX / F2f9VUkpWH / RKP + LZ / 1ISUmSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSkl KSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklIXf0ur / i7P8AqqklKw / 6JR / xbP8AqQkpMkpSSlJKUkpSSlJKUkpS SlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKQu / pdX / F2f8AVVJKVh / 0Sj / i2f8AUhJSZJSklKSU pJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUhd / S6v8Ai7P + qqSUrD / olH / Fs / 6k JKTJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSkLv6XV / wAXZ / 1VSSlY f9Eo / wCLZ / 1ISUmSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklIXf0ur / i7P + qqSUrD / AKJR / wAWz / qQkpMkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUk pSSlJKQu / pdX / F2f9VUkpWH / AESj / i2f9SElJklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJ SklKSUpJSklKSUpJSF39Lq / 4uz / qqklKw / 6JR / xbP + pCSkySlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKU kpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpC7 + l1f8XZ / 1VSSlYf9Eo / 4tn / UhJSZJSklKSUpJSklKSUpJSkl KSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUhd / S6v + Ls / wCqqSUrD / olH / Fs / wCpCSkySlJKUkpS SlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpC7 + l1f8XZ / wBVUkpWH / RKP + LZ / wBS ElJklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSF39Lq / wCLs / 6qpJSs P + iUf8Wz / qQkpMkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKQu / pdX / ABdn / VVJKVh / 0Sj / AItn / UhJSZJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJS klKSUhd / S6v + Ls / 6qpJSsP8AolH / ABbP + pCSkySlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUk pSSlJKUkpSSlJKUkpC7 + l1f8XZ / 1VSSkOHmYgxKAb6 / 5tn57f3R5pKTfbMT / AE9f + e3 + 9JSvtmJ / p6 / 89v8AekpX2zE / 09f + e3 + 9JSvtmJ / p6 / 8APb / ekpX2zE / 09f8Ant / vSUr7Zif6ev8Az2 / 3pKV9 sxP9PX / nt / vSUr7Zif6ev / Pb / ekpX2zE / wBPX / nt / vSUr7Zif6ev / Pb / AHpKV9sxP9PX / nt / vSUr 7Zif6ev / AD2 / 3pKV9sxP9PX / AJ7f70lK + 2Yn + nr / AM9v96SlfbMT / T1 / 57f70lK + 2Yn + nr / z2 / 3p KV9sxP8AT1 / 57f70lK + 2Yn + nr / z2 / wB6SlfbMT / T1 / 57f70lK + 2Yn + nr / wA9v96SlfbMT / T1 / wCe 3 + 9JSF2Zifa6z69f83Z + e396rzSU / wD / 2Q ==
2JPEG256256 / 9j / 4AAQSkZJRgABAgEASABIAAD / 7QAsUGhvdG9zaG9wIDMuMAA4QklNA + 0AAAAAABAASAAAAAEA AQBIAAAAAQAB / + 4AE0Fkb2JlAGSAAAAAAQUAAgAg / 9sAhAAMCAgICAgMCAgMEAsLCxAUDg0NDhQY EhMTExIYFBIUFBQUEhQUGx4eHhsUJCcnJyckMjU1NTI7Ozs7Ozs7Ozs7AQ0LCxAOECIYGCIyKCEo MjsyMjIyOzs7Ozs7Ozs7Ozs7Ozs7OztAQEBAQDtAQEBAQEBAQEBAQEBAQEBAQEBAQED / wAARCAEA ALUDAREAAhEBAxEB / 8QBQgAAAQUBAQEBAQEAAAAAAAAAAwABAgQFBgcICQoLAQABBQEBAQEBAQAA AAAAAAABAAIDBAUGBwgJCgsQAAEEAQMCBAIFBwYIBQMMMwEAAhEDBCESMQVBUWETInGBMgYUkaGx QiMkFVLBYjM0coLRQwclklPw4fFjczUWorKDJkSTVGRFwqN0NhfSVeJl8rOEw9N14 / NGJ5SkhbSV xNTk9KW1xdXl9VZmdoaWprbG1ub2N0dXZ3eHl6e3x9fn9xEAAgIBAgQEAwQFBgcHBgI7AQACEQMh MRIEQVFhcSITBTKBkRShsUIjwVLR8DMkYuFygpJDUxVjczTxJQYWorKDByY1wtJEk1SjF2RFVTZ0 ZeLys4TD03Xj80aUpIW0lcTU5PSltcXV5fVWZnaGlqa2xtbm9ic3R1dnd4eXp7fh2 + f3 / 9oADAMB AAIRAxEAPwD0TBGNZjVAVNA9No2lo00CfIUsBtsDExm + / Y0fIQhZTQCN2PjiSGN2 + QCIQUbTjs4r AI8gjS209Jx36FjPuCaYrxJofWDoVXUsYPx62DIr1aYA3N7t4UmDLwS12WZcfGNHib8OzGsNWRV6 bxy1whaETGQsNQgjdh6TP3R9yNIXFbP3R9yVKtf02fuj7kqUv6bP3R9yFKXFbP3R9yVKtf06 / wB0 fclSrUK2fuj7kqUv6bP3R9yVKtf0q / 3R9wSpVr + mz90fchSrX9Ov90fcEqVa / ps / dh4JUq1 / Tr / d h4BKlWv6df7o + 4JUq1enX + 637kqUsa6949o4PbzahSre2oJc1lni1sn5LP6NxjblncW9gnCKrUMs BqXCriYtc17pJ5SUG7W2gDTlMNrxSVh7dk0pDV6n0vH6rQarRteNWWAatP8Acn48pxlbOAmHFp + p 2y9vr3epVB3Bo2me3ipzzemgYhy + rA / VCwvsDbQGmPSJ1PnuR + 9jsj7u0sz6tdQxQXNAuY0SSzmB 5FSQ5mElksEouVCmYV0lKASSvCSl4SUvCSl4QUuAkpcBJS8JKXSUpJSx + m34H8rUOqnsMauwUsEy Нет / Is8lu0zsxX7C4RxqERJRDSNVk / RkJ / EFtJKyWHUIHVIbTLPNMTaZlpjQoEJtM22RLk0hcCvvB EhKlWovDhEwUqVbCyxorOvA7ogaoJ0eQy8bIyXOproaCxxfuYIkdyr8ZCOttQxJcwscCWkajRS2x rQkpeElLwkpdBS6Sl4SUvCSlQkpeElLwgpYj9IPgfytSU9lVU4VMcHES0fkWfbdpKx7ohxQpLF3l qihb0mPEkJWmmQxhEoWqkGRlV4e0PEl5gAJ8YGS2UuFqu6swsLmgAzAaXAJ4wm1nuI7uotLSyqwt s8BqnRx90GbD9pWV5Aqushncxroj7YI0Rx0Wd + aNvq1P3gdvHyQjBRk1x1uxtZNdLfBxJ7nwCd7I vdHumnJuuba4v2NBMzAhTgUxE2jAYWmfpdkUMdqSlQkpeElKASUvCSlwElLgIKXhJS4CSliP0jf6 p / K1JT2dHqOxmNfA9g9p + Czm808zHyGs9THe8EEaauH / AEVLCQ6rJRPRo219bc5vous1I9zgGNj5 6qQHEN1hjNe7qPV + nEMya22SYDm9ylHHjnsgznFdzuv5NYua0VNnQSAT8kh7QNJIyFCbOrsPp3UO ufBIMTp4o1j6Fb6 + zVeLsTID8qgVlzdARI1UgqQ0K03E6sbh43NZayrZUHbWvA0n5JChpaDZdSj6 t2Pa92VdtLtWbByD3MqGXMgbBmGDuU7ugVVtmm58t7Hv + RNHME7hJwjovV0WqoF9rRY551PgI4SO YlQxAOZldEurJtDTsJJLWCdoU0cwOjFLEQ5tlWwgeInUEflUoNsRFMYRQqEkrxKClbUlL7UlL7Ul LwkpeElKhJSxH6Rv9U / lagp6 + hpbRW57uWj8ioN2qTDIn2tQ4UiS4dAjxSpKnNrfEiUtVLiJ11QU vDRqBqUlOX1ivGta2q8lp1LHjUA + YU2EyGoYsoB3ZdPfj01V49Y9oBI3kTPcwhkBJtMCBo3Rad0z uUdLrRdRynY9BexzQ7wiSnY4WUZJUGv0zOdfj + tlWMGp044T8sKNALcc9LJYZfWh2PIxw21g5Mgj 8EYYQd0SykbOd1m + rILXFobYACCO4PYqXDExY8srcvWIUzEqElLpKXhJS8JKZNA7oKXhsd5SUtCS lQkpYj9I3 + qfytSU9BbkWtprEEAMERxwqcIhtklenMAGvKUoqBblWR6h0hMIXAthrieE0hcrlvuA nwCSmraMmuwxD2O4bMR81IOEhYQQXM6va1j63vYToYG4jVTYRYYshouQ5 + 8 + o0neew / KpwKYTquz MzKfa21zY7SgYRPRPEQvZl5Nxmx5J4njRIQAQZEoYKchKMbIguFb4aJJg6BN4gu4SjjxTlqtqSl9 qSl4QUoBJS8JKXSUvCSlQkpeElMSP0jf6p / K1BT0FWXU6pjSx59o5HkqfCW5bYpqoeJ26eaaSUgB IaqGtLxIPhKVlOjyHVnusz7XPgnQacQAIQmKKoGw001cpJSSul1kxoApMWI5GHPnGIeKz21tcWsc XECXGNB + J7qTJyvBDiJYcXPDLk4AExwwHPa61oDNJ55Ma + Crt1TsWto3G2AdQSORAd4 + aSmu4bXF vgSPuSQskpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKXY9zDuaYRjIxOiJREhq6I1APiJWgDYaJFFYj9I3 + q78rU kNdvU81zGE2EQBEADskMUQNlxnK0h6lnOibnacAFL249lcckzes54YGbwQPECU04YWn3ZNHJtfdc 6ywy4xJ + AVTOAJltYSTBEo16klJq7g1gb3E6zGvY / RPElT4 + Y4I1TWzcoMkrtGQzhsCeef7k3Lnl l3XcvyuPB8u6WzI9QQ4mO8uJ / gomfVYvrc0NfJjj3eUfulJSMwSTuGvx / uSUtA / eh5 / 3JKVA / eh5 / wBySlQP3h + P9ySlQP3h + P8AckpUD94fj / ckpZzNzYDo89UlMPRP + l / KkpXon / S / lSUyawsBBdu1 mUlLpKdSsexvwCvw + UNCW5UR + kb / AFXflanIVjU9EdjVB77BYWiT5wmE5bZv1bRexrXlrTuAOhUw OjCVAJIZBqaQCkEsw0eCHCOybKDqIh3G7 + qn44jiCzKTwFwqWUmsF4YTrO55aefCE3PlyxyEAmvJ HLYMUsYJAvzYuxwXEtsrA7DdMfgnw5uo6iRPksyclcvSYgea32f / AIWv / OTvvkf3ZfYt + 4z / AHo / ar7P / wALX / nJffI / uy + xX3Gf70ftWNEAn1KzAmA7VIc3En5ZfYg8jIfpR + 1fHbW7d6gaeI3OLfyJ c1knCuH8rTyeKE74h + NJTXQQQBUDGh9Q6fgqw5jNe5 / xW2eVw9h9pRfZ / wDha / 8AOVn75H92X2NT 7jP96P2onDa4iQY0kcKeE + ONtbJAwlSycsZ0hpsAfBGs7jtHHios8pRxkjdm5aMZZADs2DXQQQBU DGh9Q6fgqQ5jNe5 / xXRPK4ew + 0ovs / 8Awtf + crP3yP7svsan3Gf70ftV9n / 4Wv8Azkvvkf3ZfYr7 jP8Aej9qxx4BPqVmNYDkvvcf3ZfYj7jP96P2olZaix + kPgf4JdU9Hp6h + jb8AqQdNJCSmQakpmGt 0gme + iCnQpHShUPU9T1O581FL3LZQcdNHPpZlU3MY4zYCBIj4cKXGTEhiyREgXmRY7GHo3epW5sy 2Gxz5hDNy8skzIALcHMQxYxGRIKvtbP37fuZ / co / ueTsPxZfv2L94qdlVuBaXWwRB0Z3 + SI5TIDd D8UHncRFcRRfqn / Cf9FWb5ntFq8PKd5IVZGzUNXomx7m1bpLhMfRAPH9ZVuawyyVQbfJ544rspft bP37fuZ / cqv3PJ2h5tv79i / eKvtbP37fuZ / cl9zydh + Kvv2L94ov1T / hP + irV8z2i1OHlO8kT9m4 + nO3tu5 / BTY + Ph9W7XyiAl6NmVLxXYHkkATq2J4803PAzxkBdy0xDICWx9rZ + / b9zP7lR + 55Ow / F 0fv2L94q + 1 с / фут + 5n9yX3PJ2h5q + / Yv3ir7Wz9 + 37mf3Jfc8nYfir79i / eKCz0I / R79067oj8Fcw + 8CBICmjn9ggmJNo1O1lj9IfA / wS6p6PeVdIpNYP2qsaAiddI7rKGc / uu17I7ta7GNDg3e14PDmG QpYz4mKUaYhqchkAkhcBBNLwkpfakpm1pPCCWxRXin + kWub / ACWifxTJGXQLoiPUsbRWHkUuLmdi 4QUY3WqDV6MQ0lG0UuHPBBBII41SVaZuVktECw / lTfbj2Xccu6xLr3g3WQTy49vuS + UaBHzHUpGU YsnffA7Q0yUDKXZcIx7pqPslJ3i18 + AG2fimS4z0XR4R1TbcS + 8Xh8HksiePim3KMapd6ZSu17mY tz9tlziBwNBB + KETKI0CpCMjqWpkUY9cCqwvPef9ilhKR3DHOMRsWuBCkY2bHPYdzCWnxGiBAKgS EgfkXEtBc / TUSSm1GK4GRRnGv9Rp2H6Lvjy1Ljj3VwS7Obh5XQsypgxs1rHbRLbRtdMef8EwZZjc MxxROxbDq6qztZttH72sFPEiVhiAweGk + 1u35ynxK0hnTQbT9JrR4uMISmIqjC2ZxHtJG5hgxIcE BlBScZTjp3B9QERrA4KZ7 / gv9nxRWYxr0Euj6RA0HzT45LWSx0lGNQBPrccwP9qb7kuyeCPdb08f gWfe1Lil2Vwx7sSxoHtMpwK0xSVilrdxcRYOBAITZGV + C6IiB4rF7nu3PAd8o / JCIFBFkli5upiP kiCghUI2imTa9xiQPiUDKkiNs31NZxY1x7gSmiV9EmIHViB5wnLVw1zjDQSfAapEgKAJUWuBgggj slYUQWTKLH / RbKBmAkQkWb8cMbBsG7u3 / amjJfRJx11RgObwY + BTrBW0QxO / 1WunXa4zPm1LRVF8 h + 3t3CNABMKuc2rZEG9j / WjqOMW102u9MRLXHcNfAGUBmJKjB16 / rl1NrfYa5IgnYCT8ZUpAK0WF H65dXMkmuXc / o2yiIx7qsonfWDqlgM3FoP7oA / IE61tNc52YXb / Ws3Hk7iP4oWFUy / aGeYByLNP5 R / vRsKpk3Ny2nd69k + O4 / wB6VpAS / tXqEQMm0D + sUrRQZt651esjbkkgfvAO / wCqCdYQQnq + s3WW WbnWMsEyWuY2PwAQICdXUo + t7HDbl4jZ7updB / zXSmUR1Toejcr + snR3EFxsYO4c2T / 0XFK5K4Yt pnWeh4O2tyAwnjcC0fiE3imE8MS3WZXTdwa22pzncDcDP4ppM0gRaWR9YuiYnUBg3Oa18SXTuDT4 QJQ45bWnhj2RN + uGBZW5 + Iz1dri0OIDWwE6GPjF2iU + Hoix / rFk5FlzKq2NsDfVpGuob9NvIVaRO LmOGR9JZhEZMPENw5uV1rOzDNlu0Dsz2j8Fpwxxi0pSMmFfXcrCE / aPZOoeZE / NKUYdVDi6Nx / 1n 21hzq2bncEvgGU3hiOqtSjZ13PyLCKhX8GifvlCZhHqmMZSRnrXUPtDa943wfbtHi3yS4sdWngls 8Eeh9RbG303CBPu8fiAsz3Ytulj0PqoaS1rQ4eDwl70O6KTVdN6o1p3NBLtR7h4RGWHdRDL7h2Ko bntbH9YI + 9j7opM3C6qNDW0E + Dh / emfeI91Ur7J1NrJc1odxBd4 / DRPHMQ7opIzE6kW / RYCRyTKX 3qA6q4VHD6rH0ax80Pvce6uEL14PVwQC6sAdySfyBIc3EdVcIZ2YnVnDdU + kNiQ4zx / mo / fY2jgC vsPWQ8EWUuEDmRPj + ah9 + ingim + w9SewFt1VbhzoTP4JHnoo4I91VdP6kytzLLq3k8OO4lp / zUhz 0QFGAPVa3B6k5rRXdWwgHdG7XT + qkefBVwAIR0rqbzvN7DrzLv7kw84PFNBB + xM + w7xdWX7nNJO6 ZBSPNRTonp6h2RrC1t7dfpEbuxlIc4EcILbw6ep9PyG5brm3PrILWxyR2 + 5RZ84zBlwyGMsM3Azc rLutxsprKLH7mthxhp128jhSDnCBrbHKMbQ3dG6jcwVvy2 + m0zGyf4pHnr3W8IBVb0HIsa2s5Z2s AgFv + 1D77fRNB3egY7ul1PNjvWNj9CRHOniVFkzmbPgAKd2FHX2ZG / R1T3hkfulgPf8AlJe / 6aTw + tGMVr6Ww0HQTCVC13AOyjgMEDbwI803hBQcUeywwGwBtLYGmvglwhHtRWuwKbqi1zC0a6h0FIRp XtRSDFYQQJnjmfyoHGFezFjbiVPZtaHA8 / dr4ICGqvZipuPXESWzxp2S9tHshYY / i4jx00S9tXsh c4rSRteTHigYFBwDuhbhuDXN5EkgeUyETErTgLM4tsxIIHyhN4Cr2SsMVzXExJPcaykYyR7cmX2d 5PGg48U3hkr2pK9MkkASRofOUuEo9uS / ouOgbqhRSMUuzCui5l1rS0hroe3ynQ / kRI0Cfak3cO1t W6lzdXDv5p0NAvhDTVqXF1b3TEAnQhMpilGiy2vDQ6Gz3CagxKx9XcAWNg6HXhGgiiyb6fcx8BPC abQxuyHNsrprP0jMqWA9LZwaOu7Hq9Rjt3v9F + vzYlQXX63Ma4Na2BI2gqcrwnrN5aSIHmUKVaX3 mN8ajVKlWgfYWtcAJLT + VIqRerY0wI14hBSXHutcHNuESYPkgUhOHU6H6To + OqItTPY17I0HxRoo RvqgkAgtHy0SUAxLQOOPEdkrVSxaGiSZJ5KFqpQYHag6RqfOUVLMxA4kiY766IjVWyVuI0skRJkF KkI7KC0wfzR2OiCQybU4gbhAPY + KVKYWV1U312hwA7hGtEdWWRUy631GeGnyTaVQUMW2CA4A + BS4 VaKfiOAJc4SIJS4VUC1G0WP9o1PYjxQ4AtMA1M8HGyqiXDTkd04w0VGousRbtbkaR6Tj + LEPb0TY u0VLfVaHDsBp5wncK6201sCX6EIoKOxxEu0ED5Iqpo + oX6xEn8qamlw0kbm8GSgQkEL7niDMzyPg hSbbVb2saWkSTyfNOAQSsLWAHWCihhfdMNGm7Uk + CBSwlzRPb + / hDhTa4ybJLSOe6VI3Z4 + 5zi1x 9oAkfBEIKfftd7TA4Mo0hJW5gAO6B2RUgFhJc8 + 4T7U2lWkY51kmeE6lOZ1d7qIsJ0b2RC0u106z Htw6xaNr3DkqPUFeNQq1npPI40gecp26HPt9b6Dj7nmB8EkOjXhs + zizEeLCADa2IcPEhKwp5Xrr 2nNlh0jVPCyTruzGfZGMn / tO / wC + WJqtaZUXMroaBMxqQJ57oWy0scoPiJ5JGngkpY2OuEBh20 / 1 + 5AhNsXRSA5wkRGqSLtk3Ia9uysaaRAnhFVMBW4ncWEAa8IKtLXYxrdrp3GPxStLI7HjaWkE8nWN NOAlaqQOlry9wJgQZGnCBVTF + SXt2tGqKqpTWPngwPLmUlNnGtrpMWCNxifuTgtKr82gWENE69vB IqAVZktd9EQBI + KaSVwC7cmhrNpB4PPEoopJRmY94OHXXFzWGytw / Og6t + 5NMqKuFwvrAMgsY8g7 QRIAUkVk2x03qAyOnluofVJafgmzVAu7XkDqPTBdS0usYNfiEwGiySi5m + 1t3qXAn5aA8JwWUWdl tuPYLKrNj2e4QdCO4KOhVRDzXVsuy3Nc9lJaXHWRoD30Txsxyd11R9FgjX0Hu / FiYnotRvs49rQA I8uUatf0bFVWwmOOx8UVWkYHitzm6dwD4pIJabN9wL3kbHEmPCUKXWzADCGg7dSIHYaIotjblFhL QSDxHxQKLRsL63n1CCe88AykACkSbBvc9hlwAcOUqTxNa2 + 1x9PdJf2 + CRCQW3XW1jQGmX9z / clS LSFw7f6 / 6wkq2ve7VoGuwSfjygUoLIOwNAPE + MT3StTEOcwOkgmdB3jxSQC2aWbo3j2njXzRpVr3 k4tleZXoaHAwP3e6BFpBa / 1msbVQXsI2O9zR5ESPyp8AsmWv9VqSay6wTvnT4juhMLY6O50vKOE + ygn2zLUwhlvRL1qhzqWZlDYbbAeB2nulaA51LGslxkn8J8kQEktbKwTfe0xq + JPxSs2tIDaLXeo2 jad3pubHzairoxxzW2oOLmgkTEiZP + 9JFpHW0tG0vEGDM + cfxRtVML8gOa6qskAwflxogSpEyxpb DSA3 / UIqOjNsO95dteT7Rz / rwgStKNlTsi0bwG7dfdAkeKVqpO + uss0gCPuKNpQPbUytzn2Rpuho k + aBkhFRF1j7n6EAAHxB90j7kImyklteqwe7TgAfwTkWjOUASQR4jxMeaBKeJrMttsYTIl2u46A + Ikptq4yjBdGk + Mz2RXXavcYe4fTnTvyiCp06mzUXNlzawC5w1AlK1Fl6jGwHlpDhx4hK0uZ1UDIr NI + g0Dy0SEtUEaMOg5Axsh2ZOjkZm1gDoZ9jax64gRrAMzqmrwW50Tqn7Q9VgdIA0qdxHf70CLVd K2VtyfSILQH6CRIaSnAqbOfXRigXNcLGP + iefLVNEwSijTknIf8Aa23T7pInty3Tw4StLTqa / Iew MkFupcR2BmEaY2yaaK2gkbhGs68o0FxLh227Q2uAACJjtrylS0yatTTYzeQQ1zjGzQ / ihSeLRv0t ZSdxcGkaAuGvlKcAEcTMPD6TugaEeEO0M6 / BAmlbtJ9jtsDiSB5Jq8BfFfX6u52u3t2PCVJAtN7H WFtbvaTAaBwDMGfmiNEcNrtwwJDzJbEzoJRQQkGPUDvDQ0TwRGgSpahdWwu9No0Goe2dTzh4IUoM Xsc8NbyJgO0Go80KpNkIWk1PDXagRxEx4apy50 + l5rcO5rLjNN + ljNPo8CVHMaL4kEtfNw7MfPdj EiPpV + Bafo6oxNhaTSB9LrA9oeNJknkgFE0FoBRY / TyzJFx9rTHH5UgudB2Ox9Wxo45BHj / vRUHM psd0fMDwI3kDjxRkbCKd7IoZdWzJDpLtZHb7kwCklLi + jb6uG / 6RgsLv3gENpI1a5toOS2j0hIDm ceO3t4wE9TQxaLaqq95gxEOPZ3ARCxfNqkOLSdAI8 + NfuRQS1BuY0tEHcS3yE8z8k0lDexanDaXE FrfbMawYSSLZW4ZDnlz / AG6bZEaA8 / iiohr3OaXCjf7CQSR4 + CBKqtDl0HY7YSGQYg6E6kfikult bTxRbW42Ay3SQT4pIxnV2cGmScgRtkCO890QySLZe5oJcTILpAHGmpKSLXcWNM2GQNdOT8ErpaWj vDLN4JPBgaCU3raKRl9bzv8AzQdRxBn4IJZX0gVVucNQNWjxnx + SN0kMP0ryWRDSPLQDwQ0Kinbf blYzDkA + pju9BzuJB1YdU0aFdLVjS1rMja8EhxBcNeDyE46hEdGw1sOcxwJ1IB8kSlPTQchjiwx6 Yna7SSP3T30CJNKDSyMRmXYXSA6r80 + OknhJRLY6fXbSx1N0ubPtjwQVdppf9oddcQHNLXN7TA8v xTDoU7tU3u + 1i / uSXR20j + 9G0NFj8ja0VuNhaAQAZ0hO1YW0K3emDY8l8QWt5Bb46olRRvGMK90n c0HURp3nUJaKtWLZdY57atw2x7p7caaJA2oSTWVn6Frg7UESY / 14RXNe + pljAXuJ9wDYIHeECFLs aXRWTDY0Pn8CQgNUk2FOqx31Fjyd0zA01RFLIypW5lLRW1x / SOGs8dwmyOmjJxWlDbfabnxHPgQZ Su0WmpZVuBl0u5Ljrr8OOUQAm2F7qq3 + mRu3QS6ZIJ + 5I0i2sCNm6tsvDgYd4a8DxQtaStvddbBD vcIB7SPh5wgUiS9DhYHCuZHtJPaQkCuBBbNVDSSHOJLtSNBx59 + UeFVltU24uz0 + ouDWyfTunVh7 AwONUDGtl0Txbor6cui7094FZAIeDIdOoIKaCiVgtZjbvtDHh7nOrMgkmCR276KQgEIjOi2rR6Nh uhw9Qw4OOsRwfvSjQGiiWxTS4iyqSGu1Ea + HfwKbIFIYvx2VD1LC4 + 6SSdduqB1NqGjWLKPtbTJj 0nffLf8AvqHRPVqYjSMZgLwHPbu51EdhwpmEJcgOdHuDGF0wIknnUhKwVUxtawtiZc6GOJBOvc6J sjoqrYj1W1lrNrWCRJ7gIUtAYzYCIJhvI5gJy / osALshrbHQxvuEcSOyBJKUj3Vub / KOpMdgkCVt 0k217GPc7dIMud245SJRu1Q4Ouse0y0bdngSO + qA1SE9WS1xeHGZHcSNJRpcFnWtbudPDN0 + fggj UIm2V2Al0lx1BERzrIKbra7dHLgHbJO0tgjT4cI9Vh0KZ1Tn1VtY7Y6J76jyQJRSTHbbUJsnc4ER oQe38E8qBSUWWboMdzu7IhkBVe2qwux7TuBg7e0cpaKBCWiilmrXuHt766N4aASo5WEGXEubKw30 9sCSd0 + Mf3pwOiy0 + RhbLKbA5tkD22AmJ5h43IRlZpeRWrD1yxrSTEuG5g5EA9 / BOtHEjzMkuZ6t LiAw + 4aKMaGimUurknqfuGbuO4E6RrrA5S4NUceq1F91obUWEDTa09y4cwpNChu015W2HN2ke6fM aa8 + KItMWNtLmNc9zmk6yPNolCkliLgKiXcBwaZ10dPZDqtNNP1brAbDo3WInWDCJSNkVGUa3kkG T385J4QRYTY977iXFg3SADwIPzRJVuW3W269jqnuEa6AkQPiISpJGjFrTTS9uktG4SYE + 0R2Q2KN mo3Jsa9pGzWex1 + OqNqtnYSXNdeSQBOhgEER7UlFHSWkGvh5PsJBiBqfvQUJJm1F9BeZ5gj4lNO6 0s2uFVpaxwe1pDpOsbfzfBGlEUVOzbi9pc1sh0 + 3wPl4IheQGYdkGQS2sAmQNDz9yKOKmR9SmLnF rzMDcexTaKyyxGTlP2urr9zSfdr2H + 1K0CRtsXVZmZP2Z7G7a97mT7iRzATY2N2Th5tmXT830m2Y GS5rm3a1PA1DgNJ + KUhSYmxRaj88WOc0sbLRBDtDp + dofJOssd6sRlm0EENY0jWJiPHv4pkguBsN Y1M9cY0H05OsCNsh45U69LVQtudOr9P05G4uYHbu4Lf96em27va8brNC4mWjQkiePijaramZa0ES dH7QCOwnwTSoljaxlYY2d1Z94J / dHZAJ2LXMG0Nb7nbpHaZEjUJ1KC9eI1xcSd27UnuC3t8021vV sVljK3AMPujb4DWToibtNpGGtjHANBdMhwny5E + KOqSiL / tNV1jCAGCPkNZ + aZ1R0atrGsbJcCSd QBMA8QnUlal7XFzCSCYFZI4SC22DW3svYWgteXbqy3zgSD80SBIJ2LpY9rrQaNwfuJJLmxr3cX / S 26pnBRSdmNtbTaMdtTKY50IJPInU66lC9LWSZ147KWkcSdR4pwKuJZ1Ntj / Ve4CNXAzqPknWoyY3 VMytrGaPkkkfmjx0TLIKwpjjbqQCSNp9oGpcnDRcNmLqQ + xoaS0EHdBgmPooXQUCQ0LMY1XAhwfW z6QdPuPbj4ImVoJpVlTXkXtJ3xLieJb4jjVNBrRaddVnD1awWw3aDrMS3zS2KYkrF9mwO2j1dxby eJHvlLqus09RjfU7rHpV2MDPoS39J + 8AfBWDimuZH6ndeaXFrKnbiDBfEeI0CXsyQhf9SfrE + r0j 6EST9IE8ae7bMT2lNPLyJtR2pev6kdeGG3FtFTnMJ2vFkaHt9FI8vO0k2FU / Ubrdbdz2VOtjbIsh sa9tvMFI4J34KBZN + pXXqnD0xTHeXh4PjLUo4JBA3TO + qHW3UhmyoFn0RvEfkRGCVqtE76mdeJBa 2kEHkvmf + ikcEyu4lmfUz6wMt3hlG12jm7 / zT / ZTTy0lXqjh2D62bDuFXpugn9J7twP9Vh3J0tCR / wBSOtkH021NJAb / ADk6DT91L7vNJ3SH6ldYNdbSKt1f0Xb9Ru51hh3JKtQ + pXV2lu1lI2tglr4k / CEDgmVEqr + pXWWPadtMAk6O11nyTfu81pBTH6n9XcIHptIEgl0yU4YJIpHf9T + u2fQ9MEjU741 / zSkMEgogo6fqX1xri + 1tO4jljwNdJ7eSXsTUAWyfqn1naIbWXNHtO / gofd5ppjZ9UetuJLBUCRzv 1 / Il93mo212 / UjrUDeKiRqffM / gh92mt4SofUbrTZE0lr2 + 4boIOvkkeXmrhQ / 8AMLr0yPRiYLS + Wluvbb5p3sSVwlR + pHWw9rNtPqOa5wG / 2 + 3aP3f5SX3eauEvoOH / AESj / i2f9SFbXpklKSUpJSkl KSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSklKSUpJSF39Lq / 4uz / AKqpJSsP + iUf8Wz / AKkJ KTJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSkLv6XV / xdn / AFVSSlYf 9Eo / 4tn / AFISU57 / AKyYbHuYaMklpIJFWmnzSUx / 5z4f / cfK / wC2v9qSnSxMpmZjsya2uY18w2wb XCCW6j5JKTJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSlJKUkpSSkLv6XV / xdn / AFVSSkOH mYgxKAb6 / wCbZ + e390eaSk32zE / 09f8Ant / vSUr7Zif6ev8Az2 / 3pKV9sxP9PX / nt / vSUr7Zif6e v / Pb / ekpX2zE / wBPX / nt / vSUr7Zif6ev / Pb / AHpKV9sxP9PX / nt / vSUr7Zif6ev / AD2 / 3pKV9sxP 9PX / AJ7f70lK + 2Yn + nr / AM9v96SlfbMT / T1 / 57f70lK + 2Yn + nr / z2 / 3pKV9sxP8AT1 / 57f70lK + 2 Yn + nr / z2 / wB6SlfbMT / T1 / 57f70lK + 2Yn + nr / wA9v96SlfbMT / T1 / wCe3 + 9JSvtmJ / p6 / wDPb / ek pX2zE / 09f + e3 + 9JSvtmJ / p6 / 89v96SlfbMT / AE9f + e3 + 9JSF2Zifa6z69f8AN2fnt / eq80lP / 9k =
96256JPEG / 9j / 4AAQSkZJRgABAgEA8ADwAAD / 7QAsUGhvdG9zaG9wIDMuMAA4QklNA + 0AAAAAABAA8AAAAAEA AQDwAAAAAQAB / + 4ADkFkb2JlAGTAAAAAAf / bAIQABgQEBAUEBgUFBgkGBQYJCwgGBggLDAoKCwoK DBAMDAwMDAwQDA4PEA8ODBMTFBQTExwbGxscHx8fHx8fHx8fHwEHBwcNDA0YEBAYGhURFRofHx8f Hx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8fHx8f / 8AAEQgBAABgAwER AAIRAQMRAf / EAaIAAAAHAQEBAQEAAAAAAAAAAAQFAwIGAQAHCAkKCwEAAgIDAQEBAQEAAAAAAAAA AQACAwQFBgcICQoLEAACAQMDAgQCBgcDBAIGAnMBAgMRBAAFIRIxQVEGE2EicYEUMpGhBxWxQiPB UtHhMxZi8CRygvElQzRTkqKyY3PCNUQnk6OzNhdUZHTD0uIIJoMJChgZhJRFRqS0VtNVKBry4 / PE 1OT0ZXWFlaW1xdXl9WZ2hpamtsbW5vY3R1dnd4eXp7fh2 + f3OEhYaHiImKi4yNjo + Ck5SVlpeYmZ qbnJ2en5KjpKWmp6ipqqusra6voRAAICAQIDBQUEBQYECAMDbQEAAhEDBCESMUEFURNhIgZxgZEy obHwFMHR4SNCFVJicvEzJDRDghaSUyWiY7LCB3PSNeJEgxdUkwgJChgZJjZFGidkdFU38qOzwygp 0 + PzhJSktMTU5PRldYWVpbXF1eX1RlZmdoaWprbG1ub2R1dnd4eXp7fh2 + f3OEhYaHiImKi4yNjo + DlJWWl5iZmpucnZ6fkqOkpaanqKmqq6ytrq + v / aAAwDAQACEQMRAD8A9HaD5z8va3am4srpVC8f UjlpGyll5Dr8J2PVSRiq / wAyTwXHlHVpoJFlhksLkpJGwZWHotuCNjiFfEHlD8nrzU / JEHmoWsuq pdTSxJZWcVzNJEkNQzymFOC7joWrQg0y0lDGdR / Kr8x7dbi8fynqtrYxlpC0tpOqxx1JHJmXYKOp ONhXpP8Azi1oGr6X + belz39s0EV9p969szFTyEdFbYElSD2ahyJS + 1Mgr5p / 5y58neavMur + Wk8v 6Vdao9tb3bXC2sTSlA7xBS3EGleJycCr54P5Sfmb9YNv / hnUPrC05Q + g / Mcvs1Wld + 2WEbX0YCcS SAdxzXXH5O / mpbwSTzeVNUSGJS8jm1loFUVJ6dhkLZPsj / nGD / yRnlr / AKPv + 6hcZA80vU8CuxV4 v5d8s6Ktnpl / Cbe3 + sRtNdoSs8gmkmUiUO0ciH0ljDBRStAOmKvSNRktZvIt + 1m / q2zafcCBgnp1 X0mAHCi0p0pTCOavkPSvzvtLK2EEnlyASyci4S3gep7cTIpbtmfky8Rvhi4sMNCuIrj + dtzfyw2O leXLJ5bqT0G + sQ28akyMvFS3Hgo5bksQB1OV + NGO5jFl4EjsJFOP + ce4deT89Ld9YqkkljeTRWoY tHAs / wC99FFJPp8S5rh2U9RXMQZY5LI73KliMKBfYWBi + Zf + cv8AVvMOnar5YbRr67sWlgu1mNnL JCXo8RUN6ZWtN + uW442gl4bpn5wfmFp9ukCX5uWRuQnugZ5mNSQGkc8m67V + WZUc0oitqaJYIk8X Usg0f8w / za1aG + ubd4Y7W0ieS6nljEUQojP6XJiFMkio3CP7TUNAaZVk15jV1z7mUNEJXufm + j / y P0a38yfldous6i0sN5dG6Esds7QRD0ryaIcYxsuyCvvkpa2d8h8mH5SPefmzxPI2jo6t612eJBob h6bfTgOsn3D5KNLHz + bIcxHJeA6IdSsP8Px3BivDPGba3tXkurUrxmZKNDGjRvxq + / gF37lV7FfW rWPku8t3qzQWE4NGZjtE23NuTH5nG6V8ZeX / ADd5f0vR / wB5oFnquoSCH0TeFvVQryNUah / d + mXV 0J3JRh9jK55JyJINNsYxHmpeW / PVvpN7Hb6foyRtCS8V2kohKxlJkZJHCuZR / pHxb / FxANQF44uf HKYoy2r8dXIxzAO0Xqv5Sap + lvzst7 + e4tri6ksbtybIuI4yx5NE0cvBgTz5llUg7bkknJ6cCOwu vNhns7vpnMtxXz1 / zk / f6daeYfLh2 + A3EBtdQqnNlXkRGqN8JU1Rm5dxtuCMBySAodWUYg7vEtX1 / wAjRyvJp3laGBbZSlvcx3TzeuVTizusqruxLMOAQjagBFcovIRvL8fNsFA8mWaX + aMtxoV3bR6X punJOZJUN2TMDE3KRYliREgUpUqnMUHPoKk5hHT / AM6Ujfd9 / NyhPuFPoD / nHlSv5QaED / PfEbg7 G / nI3UsPxzZwNhwZii9GyTF2KrDBAWVzGpZPsNxFVr4HtirpoYp4ZIZkEkUqlJI2FQysKEEeBGKv NV8k / k9 + mGvHt9DNoIfShtRbQiRWqCXM5YsdqjiABvl35XJ / NLT + Yhd8SpJ5G / JUxmPTdO0O1u5C FSUW8L9WFRxBSpPbfJR00gblEkMMmYSjUJiMu / n9mzJdB / L7ylomoNqVhpNjbX / Eot1b26xSBWFG BYEk1zGoOVZZJhQlGu + T / K3mB4n1vS7bUXhVkia4jWQqr0LKK9m4iuK2k5 / KD8rmiWI + VtNMSV4x m3j4iu5oKUwUm1QflP8AloE9MeWdOCClEFulNum1O2JAUEsg0rSdM0jT4dO0y2js7G3BEFtCoSNA zFiFUbDck4UWi8VdirsVdir5wkdkYHqnQgDep71rnUyJB8nnQLXqzfaHw91Pfx + jGZ9J9yY / UGb / AJU3l3N5iuFmnkkUWjkK7Mwr6se + 5zly9AHquBLA / wA2bi4g06wMMrxEzMCUYrX4fbCEF5n + k9S / 5a5v + Rjf1xV36T1L / lrm / wCRjf1xV7n5Ud38taY7sWdraMsxNSTxHUnAlNcVdirsVdir5xa5mjcL 6jCJaMEJYKGr9rc8a / jnTmhK3nxZFNq1Qa12r1wyPpKIj1BmX5R / 8pJc / wDMG / 8AydizmC9AHreB Lz / 83 / 8Ajm6f / wAZn / 4jhCC8uwq7FXvflH / lGNL / AOYaP / iIyKU2xV2KuxV2KvnCdEErrT4lJUuN iQDm1PaIP8P2 / sdcNDX8X2ftb9T2xl2lYrh + 39iI6Cjd / YzP8o / + Ukuf + YN / + TsWasuxD1vAl5 / + b / 8AxzdP / wCMz / 8AEcIQXl2FXYq978o / 8oxpf / MNH / xEZFKbYq7FXYq7FUpPlLyyxJOl2xJ3J9Nf 6Yq7 / CPlj / q123 / Itf6YqiLHQtGsJjNZWUNvKylGeNApKkg0qPcDFUdiqFv9L07UERL62juUQ1RZ FDAE7VFcVQf + EfLH / Vrtv + Ra / wBMVd / hHyx / 1a7b / kWv9MVTOCCG3hSCBBHDGAscaigUDoAMVX4q 7FXYq7FXYq7FXYq7FWK / mZNND5Xd4naN / WjHJCVPU9xiFeQ / pPUv + Wub / kY39cKHfpPUv + Wub / kY 39cVe3 + TJHk8raa8jF3aEFmY1J3PUnAlOcVdirsVdirsVdirsVdirEvzR / 5RST / jNF + s4hXjeSQ7 FXu3kn / lFNM / 4wj9ZyKU7xV2KuxV2KuxV2KuxV2KsS / NAE + VJKDpNFX78QrxvJIdir3byT / yimmf 8YR + s5FKd4q7FXYq7FXYq7FXYq7FVK6tba7t3t7mJZoJBR43AZSOvQ4qlP8Agnyp / wBWyH7j / XFX f4J8qf8AVsh + 4 / 1xVNrW1t7S3jtraMRQRDjHGvQDwGKquKuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2K uxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Ku xV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Kux V2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV 2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2 KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2K uxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Ku xV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2Kux V2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV2KuxV // Z
uuid: 969d7322-eb4f-4cf1-a445-717dc0d4f62dxmp.сделал: f628a2a7-a575-4710-94d6-f287fd383819xmp.did: 0EDCestive204FBE21183E1DC23347 proof: pdf
createdxmp.iid: 0EDChibited204FBE21183E1DC233472013: 50Adobee09: 50A09
Savedxmp.iid: 13DC5E5204FBE21183E1DC233472013-08-02T10: 23: 54 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: FC578ED009FBE21183E1DC233472013-08-02T10: 23: 54 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 02588ED009FBE21183E1DC233472013-08-02T10: 52: 26 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 03588ED009FBE21183E1DC233472013-08-02T10: 52: 26 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 04588ED009FBE21183E1DC233472013-08-02T10: 55: 47 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 05588ED009FBE21183E1DC233472013-08-02T11: 00: 20 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: C5652CD20FFBE21183E1DC233472013-08-02T11: 06: 54 + 10: 00 Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: C6652CD20FFBE21183E1DC233472013-08-02T11: 07 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: C7652CD20FFBE21183E1DC233472013-08-02T11: 07: 25 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: C8652CD20FFBE21183E1DC233472013-08-02T11: 07: 25 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: C9652CD20FFBE21183E1DC233472013-08-02T11: 08: 19 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 1787294A10FBE21183E1DC233472013-08-02T11: 10: 15 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: E40C0DC5D10AE3118096AA18FFF553AB2013-08-22T12: 36: 28 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: CE15CC124F10E311854CB1C84D8DF5AA2013-08-29T12: 02: 35 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: D415CC124F10E311854CB1C84D8DF5AA2013-08-29T12: 02: 35 + 10: 00 Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: A0E124C75010E311854CB1C84D8DF5AA2013-08-29T12: 14: 47 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: A6E124C75010E311854CB1C84D8DF5AA2013-08-29T12: 29: 44 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 61625B9A7210E311854CB1C84D8DF5AA2013-08-29T16: 16: 55 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 67625B9A7210E311854CB1C84D8DF5AA2013-08-29T16: 22: 21 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 4C430B5C0D11E311AB818785AE5995732013-08-30T10: 44: 42 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 52430B5C0D11E311AB818785AE5995732013-08-30T10: 44: 42 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: D408A1BD0E11E311AB818785AE5995732013-08-30T10: 54: 35 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: DA08A1BD0E11E311AB818785AE5995732013-08-30T10: 59: 46 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: ADC775371011E311AB818785AE5995732013-08-30T11: 05: 09 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 3923BCCD1911E31190E78C327B7FF3C52013-08-30T12: 13: 47 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: E6A808F41911E31190E78C327B7FF3C52013-08-30T12: 14: 51 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 1994F1927E14E3119007D7E6DD2E8CD52013-09-03T19: 52: 41 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 1F94F1927E14E3119007D7E6DD2E8CD52013-09-03T19: 52: 41 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: B0F74D8F7F14E3119007D7E6DD2E8CD52013-09-03T19: 59: 44 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 2675C5F75D1FE311A0D892EDF9E5963E2013-09-17T15: 57 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 2C75C5F75D1FE311A0D892EDF9E5963E2013-09-17T16: 01: 07 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: F0ED523B621FE311A0D892EDF9E5963E2013-09-17T16: 27: 31 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: F6ED523B621FE311A0D892EDF9E5963E2013-09-17T16: 28: 24 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 613587EB621FE311A0D892EDF9E5963E2013-09-17T16: 32: 27 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 8454C526631FE311A0D892EDF9E5963E2013-09-17T16: 34: 06 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 8554C526631FE311A0D892EDF9E5963E2013-09-17T16: 34: 50 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 9FFD61A7A825E31198DAA3A1617167692013-09-25T16: 09: 15 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: A5FD61A7A825E31198DAA3A1617167692013-09-25T16: 09: 15 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: A6FD61A7A825E31198DAA3A1617167692013-09-25T16: 48: 04 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 8A679C6DAE25E31198DAA3A1617167692013-09-25T16: 48: 04 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 8E679C6DAE25E31198DAA3A1617167692013-09-25T18: 19: 33 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 92679C6DAE25E31198DAA3A1617167692013-09-25T22: 12: 31 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 93679C6DAE25E31198DAA3A1617167692013-09-25T22: 12: 31 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: F01BD0D5DB25E31198DAA3A1617167692013-09-25T22: 13: 06 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: F41BD0D5DB25E31198DAA3A1617167692013-09-25T22: 13: 06 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: F91BD0D5DB25E31198DAA3A1617167692013-09-25T23: 29: 49 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 84ED98222826E311BAB8B944287706F82013-09-26T07: 19: 17 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 88ED98222826E311BAB8B944287706F82013-09-26T07: 19: 17 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 89ED98222826E311BAB8B944287706F82013-09-26T07: 46: 33 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 8AED98222826E311BAB8B944287706F82013-09-26T07: 47: 27 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 2093FE112C26E311BAB8B944287706F82013-09-26T07: 47: 27 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 2193FE112C26E311BAB8B944287706F82013-09-26T07: 56: 43 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 5A41D88F4D26E311BAB8B944287706F82013-09-26T11: 47: 11 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: C606C6B04F26E311BAB8B944287706F82013-09-26T12: 02: 26 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 5B656C675026E311BAB8B944287706F82013-09-26T20: 39: 09 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 63656C675026E311BAB8B944287706F82013-09-26T20: 39: 09 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 920D58879826E311BAB8B944287706F82013-09-26T20: 43: 49 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 9B0D58879826E311BAB8B944287706F82013-09-26T22: 21: 42 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 6D9E0AD3A826E311BAB8B944287706F82013-09-26T22: 40: 28 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 94589AADA926E311BAB8B944287706F82013-09-26T22: 46: 35 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 15983F4C0927E311BBD78BD8A21940102013-09-27T10: 11: 03 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 41D0575E0D27E311BBD78BD8A21940102013-09-27T10: 40: 12 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: B6FEF4B50D27E311BBD78BD8A21940102013-09-27T11: 01: 32 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: E6CE8B5
E311BBD78BD8A21940102013-09-27T11: 01: 32 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 0AC810EC1227E311A8B881DA14D0C1B82013-09-27T11: 19: 57 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: C30205774A27E311A8B881DA14D0C1B82013-09-27T17: 57: 32 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: C40205774A27E311A8B881DA14D0C1B82013-09-27T17: 57: 32 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: 02CE1F3E492AE31180A78B5973CFA46A2013-10-01T13: 26: 21 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: A24CA046492AE31180A78B5973CFA46A2013-10-01T13: 26: 35 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: A34CA046492AE31180A78B5973CFA46A2013-10-01T13: 26: 35 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /
savedxmp.iid: A44CA046492AE31180A78B5973CFA46A2013-10-01T13: 29: 15 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: A54CA046492AE31180A78B5973CFA46A2013-10-01T13: 29: 15 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 / метаданные
savedxmp.iid: AB4CA046492AE31180A78B5973CFA46A2013-10-01T13: 32: 54 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: F095598F4A2AE31180A78B5973CFA46A2013-10-01T13: 35: 47 + 10: 00Adobe InDesign 7.5 /; / метаданные
savedxmp.iid: 018011740720681180839AB83C88A3DE2013-10-13T21: 42: 15 + 11: 00 Adobe Illustrator CS6 (Macintosh) /
сохраненный xmp.iid: f628a2a7-a575-4710-94d6-f287fd3838192016-07-07T11: 59: 57 + 10: 00 Adobe Illustrator CC 2015 (Macintosh) /
uuid: 6d18cc85-3784-a34e-96c0-7928818392f1xmp.did: 544fb2cb-86a7-4ea0-ba79-091e6bdcf1c6xmp.did: 0EDCvev5204FBE21183E1DC23347Us / Documents / Documents / Documents / Documents / Documents / 8/8 /WRP%20Plant%20-%20AMcCorkelle.JPG1AAAC9313969D8249A28203C04BD06FBxmp.iid:F77F1174072068118083C6D998670280
EmbedByReference / Users / michelle / Documents / Freelance / Clients / EMGAMM / J12011 / 2016 Commonwealth Draft Edits / WRP% 20Plant% 20-% 20AMcCorkelle.JPG1AAAC9313969D8249A28203C04BD06FBxmp.iid: F77F1174072068118083C6D998670280
/ Users / michelle / Documents / Freelance / Clients / EMGAMM / J12011 / 2016 Commonwealth Draft Edits / WRP% 20Plant% 20-% 20 AMcCorkelle.JPG1AAAC9313969D8249A28203C04BD06FBxmp.iid: F2077F11802808118808808118808808808808808808808808808908
/ Users / michelle / Documents / Freelance / Clients / EMGAMM / J12011 / 2016 Commonwealth Draft Edits / WRP% 20Plant% 20-% 20 AMcCorkelle.JPG1AAAC9313969D8249A28203C04BD06FBxmp.iid: F2077F11802808118808808118808808808808808808808808808908 849application / pdf
J12011_Final CW-EIS Cover-V2_R1-WEB
Библиотека Adobe PDF 15.00False1TrueTrue210.000280297.000111Миллиметры
MyriadPro-RegularMyriad ProRegularOpen TypeVersion 2.102; PS 2.000; hotconv 1.0.67; makeotf.lib2.5.33168FalseMyriadPro-Regular.otf
Calibri-BoldCalibriBold Открытый тип Версия 5.62FalseCalibri Bold.ttf
Futura-CondensedMediumFuturaCondensed MediumTrueType9.0d2e1FalseFutura.ttc
Futura-MediumFuturaMediumTrueType9.0d2e1FalseFutura.ttc
Голубой
пурпурный
Желтый
Черный
Группа образцов по умолчанию 0
PANTONE Cool Grey 10 CPROCESS100.000000RGB100101105
PANTONE 306 CPROCESS100.000000RGB0178226
R = 144 G = 146 B = 148 1 RGBPROCESS 144146148
R = 177 G = 157 B = 120 1RGBPROCESS 177157120
R = 88 G = 89 B = 91 1 RGBPROCESS 888991
R = 123 G = 113 B = 93 1RGBPROCESS12311393
R = 234 G = 172 B = 3 1 RGBPROCESS 2341723
R = 105 G = 159 B = 224 1RGBPROCESS 105159224
R = 255 G = 255 B = 255 1RGBPROCESS255255255
конечный поток endobj 111 0 объект > / Кодировка >>>>> endobj 106 0 объект > endobj 10033 0 объект > endobj 105 0 объект > endobj 3835 0 объект > endobj 5910 0 объект > endobj 3465 0 объект > endobj 112 0 объект > / ColorSpace> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC / ImageI] / ExtGState >>> / Type / Page >> endobj 291 0 объект > endobj 6257 0 объект > поток Hd; v; DsB + C | [y $ oS & AZ٤Z- (Sg} ?: ϏhϏO D {, XK} GZ} FO-37) c] ~ ‘s = UT7k أ * Ovh.