Отзывы звездочка для потенции отзывы

Использование препарата характеризуется простотой. Нужно встряхнуть флакон с жидкостью, 30 капель средства добавить в 150-200 мл воды, размешать, выпить полученный. Делать это нужно за один прием. Повторить действие следует через 12 часов – препарат предназначен для употребления 2 раза в день. Отзывы о звездочка для потенции отзывы

Реальные отзывы о звездочка для потенции отзывы.

Где купить-звездочка для потенции отзывы

м16 средство для потенции отзывы где в Хабаровске купить молот тора настойка красного корня для потенции	Секрет успеха капель прост – натуральный, но действенный состав и комплексное воздействие на мужской организм. Препарат является естественным катализатором выработки тестостерона – гормона, ответственного за мужскую силу, кроме того средство усиливает кровоток, обогащает кровь полезными элементами, которые необходимы для полноценной сексуальной жизни.
где в Липецке купить молот тора	Когда возникли проблемы с потенцией, не теряя ни минуты, решил купить Молот Тора, и уже через 3 дня получил свою покупку. Всего за 15 дней средство помогло мне восстановить мужское здоровье, наладить личную жизнь. От прежнего полового расстройства не осталось и следа. Сразу видно, что препарат не содержит синтетических компонентов

В настоящее время Молот Тора проще всего купить на сайте производителя. Это позволяет сделать покупку без переплаты посредникам. Заказ напрямую у фирмы-изготовителя – гарантия получения оригинала продукции. Доставка товара происходит по адресу, указанному в заявке, и занимает всего несколько дней. Это позволяет восстановить половое здоровье уже в ближайшее время, не допуская отягощения самочувствия.

Ещё где посмотреть звездочка для потенции отзывы: Проблемы с потенцией, слабое либидо, вялая эрекция беспокоят многих мужчин, особенно после 40 лет. Средств для увеличения мужской силы предостаточно, однако не каждое подходит любому человеку из-за определенных противопоказаний, характерных для синтетических возбудителей, либо вследствие индивидуальной непереносимости компонентов. Многие натуральные препараты оказывают щадящее воздействие на организм, но обладают не столь выраженным эффектом, как хочется большинству представителей сильного пола. Существует ли средство, которое действует мощно и безопасно? Знакомьтесь: капли для повышения потенции у мужчин Молот Тора – идеальное решение для приобретения уверенности и получения максимального удовлетворения. Отметим, что если не пропить полный курс, пропускать приемы капель, эффекта от препарата можно и не почувствовать, так как он развивается медленно и постепенно. Вместе с тем не стоит возлагать на это средство все свои надежды, пренебрегая полноценным сном и отдыхом, злоупотребляя жирной пищей и алкоголем. Чудесного исцеления от последствий подобного образа жизни не придумал еще никто. где в Кокшетау купить молот тора. молот тора в Армавире. уколы для потенции отзывы. народные средства для повышения потенции отзывы
Молот Тора предназначен для восстановления ослабленной потенции, независимо от первопричины этого состояния. В том числе, если половое бессилие вызвано острым и хроническим простатитом простой или отягощённой формы. Применение средства в 100% обусловливает благоприятный прогноз. Можно ли увеличить член бальзамом Звездочка? Как и сегодня, много лет назад, люди пытались восстановить и сберечь свое здоровье, устранить и предотвратить различные недуги. Какие есть мази для повышения потенции (сосудорасширяющие), как сделать мазь для эрекции своими руками, о чем нужно помнить при использовании. Мазь для потенции: какую выбрать и как сделать своими руками? 40307 0. Как увеличить член Звездочкой и пищевой содой? Неприятные симптомы многих недугов можно устранить с помощью бальзама Звездочка. Увеличение члена – вопрос, который пытаются решить, применив этот популярный препарат, многие мужчины. Как еще можно использовать бальзам в этих целях? Согласно отзывам, благотворно воздействует на мужской организм и биологически активная добавка Золотой конек. Остановимся на самых распространенных методах, в которых используется сода для потенции (подробное руководство). Щелочные ванны. Они способствуют общему оздоровлению, выводят. Отзывы Бальзам звездочка для повышения потенцииЭректол для эрекции отличается от других препаратов. Китайские препараты для потенции. Продажа, поиск, поставщики и магазины, цены в Москве. Интимные товары 1168. Крем для повышения потенции, почему он так популярен? Если мужчина начинает ощущать проблемы, связанные с потенцией, то следует задуматься о собственном ритме жизни, его образе и питании. Бальзамы для мужчин для потенции: звездочка и алтайские препараты. Отзывы мужчин свидетельствуют о том, что алтайское лекарственное средство мягко действует на организм, не имеет противопоказаний, хорошо переносится пациентами. Нельзя принимать при индивидуальной непереносимости. Приветствую всех форумчан. Возник вопрос. Одна дама знакомая, рассказывала что иногда для остроты ощущений, использует при сексе (анал, классика) мазь Звездочку. Ощущения говорит обостряются. Ходил размышлял задумывался. Иногда даже очень здоровый мужчина может почувствовать неполадки в своем организме. Не все при этом бегут к врачу, и очень мало кто желает принимать таблетки. Этот отзыв будет посвящен средству, знакомому нашим соотечественникам с детства бальзаму Золотая Звезда, более известному как Звездочка Я 1991. Сразу скажу, что отзыв пишу о звездочке только как о средстве от головной боли Страдаю головной болью уже лет 5, как минимум раз в пол года. Вьетнамская звездочка. Страница 1 Форум о мужском репродуктивном здоровье. Лечение простатита и повышение потенции Форум. Я мазал промежность звёздочкой вьетнамской. Было небольшое облегчение. Доброго времени суток, Всем читателям моего отзыва! Сегодняшний мой отзыв посвящен целительному бальзаму Золотая звезда. Однажды находясь в отпуске мы приобрели в качестве сувенира для себя и близких вьетнамскую звёздочку. Лично у нас она долгое. Читать весь отзыв Отзыв рекомендуют:221 61. Бальзамы для мужчин для потенции: звездочка и алтайские препараты. Нарушение сексуальной функции может иметь множество причин. Но если смотреть в корень проблемы, то явно просматривается три основных фактора. Крем для повышения потенции, почему он так популярен?. Средства для повышения потенции у мужчин. Потенция – это готовность и способность. Эффективным средством, о котором оставляют положительные отзывы пациенты при лечении простатита, является Диклофенак. Гель или мазь могут. Капли для потенции Молот Тора содержат ингредиенты природного происхождения, подобранные таким образом, чтобы активизировать метаболизм и повышать выработку гормонов-андрогенов, в частности – тестостерона. молот тора в Новом Уренгоезвездочка для потенции отзывы
молот тора в Коломне, молот тора в Коломне
звездочка для потенции отзывы,м16 средство для потенции отзывы, молот тора в Евпатории
где в Липецке купить молот тора.

Можно ли увеличить член бальзамом Звездочка? Как и сегодня, много лет назад, люди пытались восстановить и сберечь свое здоровье, устранить и предотвратить различные недуги. Какие есть мази для повышения потенции (сосудорасширяющие), как сделать мазь для эрекции своими руками, о чем нужно помнить при использовании. Мазь для потенции: какую выбрать и как сделать своими руками? 40307 0. Как увеличить член Звездочкой и пищевой содой? Неприятные симптомы многих недугов можно устранить с помощью бальзама Звездочка. Увеличение члена – вопрос, который пытаются решить, применив этот популярный препарат, многие мужчины. Как еще можно использовать бальзам в этих целях? Согласно отзывам, благотворно воздействует на мужской организм и биологически активная добавка Золотой конек. Остановимся на самых распространенных методах, в которых используется сода для потенции (подробное руководство). Щелочные ванны. Они способствуют общему оздоровлению, выводят. Отзывы Бальзам звездочка для повышения потенцииЭректол для эрекции отличается от других препаратов. Китайские препараты для потенции. Продажа, поиск, поставщики и магазины, цены в Москве. Интимные товары 1168. Крем для повышения потенции, почему он так популярен? Если мужчина начинает ощущать проблемы, связанные с потенцией, то следует задуматься о собственном ритме жизни, его образе и питании. Бальзамы для мужчин для потенции: звездочка и алтайские препараты. Отзывы мужчин свидетельствуют о том, что алтайское лекарственное средство мягко действует на организм, не имеет противопоказаний, хорошо переносится пациентами. Нельзя принимать при индивидуальной непереносимости. Приветствую всех форумчан. Возник вопрос. Одна дама знакомая, рассказывала что иногда для остроты ощущений, использует при сексе (анал, классика) мазь Звездочку. Ощущения говорит обостряются. Ходил размышлял задумывался. Иногда даже очень здоровый мужчина может почувствовать неполадки в своем организме. Не все при этом бегут к врачу, и очень мало кто желает принимать таблетки. Этот отзыв будет посвящен средству, знакомому нашим соотечественникам с детства бальзаму Золотая Звезда, более известному как Звездочка Я 1991. Сразу скажу, что отзыв пишу о звездочке только как о средстве от головной боли Страдаю головной болью уже лет 5, как минимум раз в пол года. Вьетнамская звездочка. Страница 1 Форум о мужском репродуктивном здоровье. Лечение простатита и повышение потенции Форум. Я мазал промежность звёздочкой вьетнамской. Было небольшое облегчение. Доброго времени суток, Всем читателям моего отзыва! Сегодняшний мой отзыв посвящен целительному бальзаму Золотая звезда. Однажды находясь в отпуске мы приобрели в качестве сувенира для себя и близких вьетнамскую звёздочку. Лично у нас она долгое. Читать весь отзыв Отзыв рекомендуют:221 61. Бальзамы для мужчин для потенции: звездочка и алтайские препараты. Нарушение сексуальной функции может иметь множество причин. Но если смотреть в корень проблемы, то явно просматривается три основных фактора. Крем для повышения потенции, почему он так популярен?. Средства для повышения потенции у мужчин. Потенция – это готовность и способность. Эффективным средством, о котором оставляют положительные отзывы пациенты при лечении простатита, является Диклофенак. Гель или мазь могут.

Спрей М16 предназначен для нормализации мужской потенции. Если верить официальному сайту, его нанесение на половой член позволит получить не только. Но таковых с использованием спрея М16 не проводилось. Реальные отзывы. Большинство отзывов подтверждают высокую эффективность спрея. Сейчас появился М 16 спрей для мужчин, на растит. основе, безвредный для здоровья, кто нибудь пользовался?. толже думаю купить вот только сомневаюсь прочитал отзывы но как то не добавилось уверенности разве что только смонений прибавилось) если м16 и правда работает и повышает. Как действует спрей для потенции, что о нем говорят реальные отзывы покупателей и медиков, являются ли правдой характеристики его уникальных свойств? Кому поможет М16. Спрей для мужчин М16 предназначен для наружного применения: его необходимо наносить на половой орган и область. М16, спрей для мужчин – положительные и отрицательные отзывы покупателей на сайте MyOtzyv. Лечил спреем М16 проблемы с потенцией. Пока прыскал, все было превосходно: стояк мощный и долгий, наступает буквально сразу же (для усиления эффекта подрастирал еще), ощущения более живые. Где купить. Спрей М16 для потенции. 98 Отзывов 0 Просмотров. Импотенция является одной из самых распространенных проблем современных мужчин. Эта болезнь становится практически нормой, поскольку провоцирует ее. Средство для потенции М16 — отзывы покупателей, мнение специалиста. Состав, инструкция к препарату. Принцип действия спрея для потенции М16. Вот я и подошел к цели своего обзора — описанию препарата для активизации либидо. Как оказалось, приобрести М16 в аптеке не получится (его там просто. 55. 21. Отзывы. 20181201. Бестселлер. Форма выпуска: Спрей. Где купить: Количество отзывов: 21. Добавить отзыв. Аналоги М16: Молот Тора. Оплата после получения. Доставка от 2 до 10 дней. Перейти к отзывам ссылка на блок страницы. Купить товар. М16 спрей для мужчин отзывы врачей. Официальный сайт средства для потенции M16. Состав спрея М16. Купить спрей для потенции М16 в аптеке можно? Если вы задаетесь этим вопросом, значит вы уже на правильном пути. И отыскал именуется спрей М16 для потенции у мужчин. ОЛЕГ 39 ЛЕТ Я сам по себе достаточно стеснительный, и в то. Пары, опробовавшие на себе M16, говорят о продлении актов на Елена Малышева минут. Этот препарат помог нам отыскать в памяти, что такое страсть и желание, без оглядки на усталость. Спрей для потенции М16: развод или нет? Чтобы ответить на вопрос о том, действительно ли спрей М16 является могучим средством для избавления от эректильной дисфункции, необходимо в первую очередь изучить официальный сайт его производителя. На нем есть много неправдивой информации. Спрей М16 для потенции выпускаемый отечественным производителем состоит из натуральных компонентов и может применяться мужчинами в любом возрасте. Как показывает практика, и демонстрируют отзывы – средство действительно эффективно борется с проявлениями эректильной дисфункции. Отзывы врачей Средства для потенции СПРЕЙ М16 отзывы врачей развод или правда? Энциклопедия лекарственных препаратов и средств, инструкции по применению, отзывы о лекарствах, фармацевтика, рейтинг медикаментов.

Лайфхак по применению Звездочки: необычное использование популярного в СССР средства

Лайфхак по применению «Звездочки»: нетипичное использование популярного в СССР средства. Фото: Людмила Лата, ИА KrasnodarMedia

Вьетнамский бальзам «Золотая звезда» в жестяной баночке-«таблетке» — средство, которое в обязательном порядке включают в свои аптечки многие россияне. «Звездочку» считали уникальным лечебным средством еще в СССР, и спустя несколько десятилетий она продолжает активно использоваться. Бальзам обладает местным раздражающим эффектом и применяется при лечении гриппа, ОРВИ, облегчения носового дыхания, для устранения головной боли в составе комплексной терапии. Кроме лечения «Звездочку» можно использовать и в других сферах. О нестандартных способах применения вьетнамского бальзама рассказывает ИА KrasnodarMedia.

Бальзам облегчает педикюр

Хотите пяточки как у младенца? Вечером нанесите бальзам на огрубевшую кожу пяток, наденьте носки, а утром отправляйтесь в ванную. Натоптыши легко снимутся пемзой и пятки станут мягкими и нежными.

Бальзам освежает воздух

Если у вас есть увлажнитель воздуха, с помощью бальзама «Звездочка», вы можете расширить его функционал до освежителя. Нужно добавить в емкость с водой совсем чуть-чуть бальзама и воздух наполниться запахом эфирных масел. Бальзам, добавленные в увлажнитель, также поможет продезинфицировать помещение.

Бальзам спасет от насекомых

На улице в летний день можно защищать себя от укусов надоедливых комаров и мошек с помощью репеллентов, а можно – с помощью «Звездочки». Нанесите небольшое количество бальзама на запястья, шею, виски и забудьте про мошкару.

Бальзам ускоряет заживление неглубоких ранок

«Звездочка» обладает антисептическими свойствами и стимулируют процессы регенерации. Так что, если нанести на незначительные ранки и царапинки бальзам, то можно ускорить заживление. При нанесении «Звездочки» на синяки, можно рассчитывать на то, что через пару дней от них не останется ни следа.

Бальзам «научит» животных не царапать мебель и ходить в туалет в положенном месте

Сильный запах «Звездочки» обладает «педагогическими» свойствами – может научить домашних животных не портить мебель. Если коты дерут когтями диваны или кресла, то можно нанести на них чуть-чуть бальзама. Резкий запах отпугнет животных и мебель останется целой. С помощью бальзама можно «напоминать» животным о том, что в туалет там, где запрещено, ходить нельзя.

бальзам звездочка для увеличения мужского органа

бальзам звездочка для увеличения мужского органа

Что такое бальзам звездочка для увеличения мужского органа?

Сначала крутила пальцем у виска, когда узнала, что муж использует интим крем. Потом поняла, что он старается для меня и стала относиться к подобным тренировкам положительно. Говорит что до Титана его параметры доходили до 13 на максимальной эрекции. После нескольких курсов он подрос до 17. Мы прикинули, что дальше мазать не стоит и такого результата достаточно для хорошей интимной жизни.

Эффект от применения бальзам звездочка для увеличения мужского органа

Сначала крутила пальцем у виска, когда узнала, что муж использует интим крем. Потом поняла, что он старается для меня и стала относиться к подобным тренировкам положительно. Говорит что до Титана его параметры доходили до 13 на максимальной эрекции. После нескольких курсов он подрос до 17. Мы прикинули, что дальше мазать не стоит и такого результата достаточно для хорошей интимной жизни.

Мнение специалиста

О Господи)))))) Я была приятно удивлена))))) За месяц получила то что давно хотела и ждала…Если честно раньше я в такие штуки не верила,но когда партнер захотел попробовать купить,согласилась …И не пожалела. +3 см. в эрекции….Мерили до и после)) всем советую.

Как заказать

Для того чтобы оформить заказ бальзам звездочка для увеличения мужского органа необходимо оставить свои контактные данные на сайте. В течение 15 минут оператор свяжется с вами. Уточнит у вас все детали и мы отправим ваш заказ. Через 3-10 дней вы получите посылку и оплатите её при получении.

Отзывы покупателей:

Марина

Я купил его просто ради эксперимента. Решил посмотреть, будет ли хоть какой-то прок с него. Сперва ничего не обнаружил, но позже стал замечать, что размеры больше стали. Не думаю, что это самовнушение, потому что теперь это видно уже невооружённым глазом.

Катюша

Крем заметно укрепил главный аппарат мужчины. На второй неделе применения, эрекция дольше, прирост 0,4 см. Главное довольна женщина. Планируют применять дальше. Побочных явлений не заметил.

Я вот что хочу сказать мужчинам. Используйте этот гель почаще, только прячьте подальше, чтоб дамы его не увидели. Просто не хочу думать, что у моего парня комплексы и он считает, что ему надо увеличивать член. Где купить бальзам звездочка для увеличения мужского органа? О Господи)))))) Я была приятно удивлена))))) За месяц получила то что давно хотела и ждала…Если честно раньше я в такие штуки не верила,но когда партнер захотел попробовать купить,согласилась …И не пожалела. +3 см. в эрекции….Мерили до и после)) всем советую.
Способен ли бальзам звездочка (Золотая звезда) увеличить половой член? . Дело в том, что увеличение полового члена звездочкой в большинстве случаев сопровождается травмированием чувствительных кожных покровов полового органа. Вот и ответ на вопрос о том, что будет, если намазать член. Можно ли увеличить член бальзамом Звездочка? . Некоторые мужчины хотят найти эффективное средство для увеличения члена и прибегают к разнообразным методам. . Половой член является самым чувствительным органом у мужчин. Его размер — это вечные дискуссии. По этому поводу даже. Бальзам Звездочка – это средство, известное каждому с детства. Бальзамом лечат все, и простатит не стал исключением. Применять Звездочку при воспалении предстательной железы рекомендуется в качестве аппликаций. Содержание: Бальзам звездочка для потенции Как пищевая сода влияет на . А при желании можно и вовсе приготовить целебную для мужского здоровья мазь . Для увеличения потенции двууглекислый натрий можно применять несколькими способами. Пищевая сода поможет улучшить потенцию! К ним относятся. Описание препарата звездочка для увеличения члена. . Увеличение мужского полового члена. Народные методы, лучшие лекарства и препараты, упражнения и . В составе бальзама для увеличения члена присутствует и муравьиная кислота. Это средство способствует повышению прочности сосудов и снятию. Звездочка. Вследствие того, что причиной эректильной дисфункции могут . В таком случае как раз и придет на помощь известный бальзам Звездочка. . Мази – эффективное местное средство для увеличения потенции, решающее проблему. Как влияет на увеличение мужского органа народная медицина известно уже давно. . Использование вьетнамского бальзама звездочка для увеличения члена. . Увеличение мужского органа с помощью меда — один из наиболее эффективных народных методов. Рецепт приготовления чудесного. Использование вьетнамского бальзама звездочка для увеличения члена. . Обзор кремов, мазей и гелей для увеличения мужского органа. Многие мужчины не отказались бы нарастить несколько сантиметров к объему и длине своего полового органа, но действенных. Обещанного увеличения полового члена. Увеличение полового органа в домашних условиях — БАДы, травы, упражнения. Как мед, звездочка, зубная паста увеличат член. . Эти народные способы больше подходят не для увеличения, а для понижения чувствительности полового органа. Дело в том, что, если смазать головку члена, она получит ожог. Как увеличить член Звездочкой и пищевой содой? Неприятные симптомы многих недугов можно устранить с помощью бальзама Звездочка. Увеличение члена – вопрос, который пытаются решить, применив этот популярный препарат, многие мужчины. Как еще можно использовать бальзам в этих целях? Содержание: Бальзам звездочка для потенции Как пищевая сода влияет на потенцию? . Не обошли целебные свойства белого порошка и мужское здоровье. . Соду для увеличения потенции не рекомендуется принимать при наличии: индивидуальной непереносимости данного вещества; нарушения. Приветствую всех форумчан. Возник вопрос. Одна дама знакомая, рассказывала что иногда для остроты ощущений, использует при сексе (анал, классика) — мазь «Звездочку». Ощущения говорит обостряются. Ходил — размышлял — задумывался. Где купить-увеличение полового члена бальзамом звездочка. увеличение пениса заказать игрушки для увеличения члена как . Препарат не просто увеличивает мужской орган – он настраивает всю половую систему на грамотную работу. Данное средство подходит абсолютно всем мужчинам и не наносит никакого. Мать её, советская ЗВЕЗДОЧКА!!! Еле открыл эту сраную баночку! Искать дальше крем не было смысла, т.к. она стояла раком и . В общем беру я эту звездочку мажу ей задницу и вставляю как можно быстрее. Делаю пару движений вперед назад и. Как увеличить член Средства Мазь для увеличения мужского органа. Поэтому нельзя не упомянуть здесь известный все бальзам Звездочка — самая настоящая советская мазь для увеличения члена. Разводишь бальзам звёздочка со скипидаром и содой, и делаешь клизьму себе. Состав благотворно. Доставка 100% натурального из Алтая от производства — Доступный магазин. Жми! · Гарантия качества. Система скидок. Доставка из Алтая. Опыт 20 лет · Продавец: ИП Ротанов Евгений Александрович. ОГ…
http://www.petit-poivre.fr/userfiles/soda_dlia_uvelicheniia_muzhskogo_organa9057.xml
http://wjvanderheidedienstverlening.nl/uploads/gel_dlia_uvelicheniia_muzhskogo_ch_l7962.xml

https://www.dancekidz.info/usercontent/file/vsia_pravda_ob_uvelichenii_muzhskogo_dostoinstva8704.xml
http://megat.pl/uploaded/fck_files/file/krem_dlia_uvelicheniia_muzhskogo_organa_faloston1835.xml
Сначала крутила пальцем у виска, когда узнала, что муж использует интим крем. Потом поняла, что он старается для меня и стала относиться к подобным тренировкам положительно. Говорит что до Титана его параметры доходили до 13 на максимальной эрекции. После нескольких курсов он подрос до 17. Мы прикинули, что дальше мазать не стоит и такого результата достаточно для хорошей интимной жизни.
бальзам звездочка для увеличения мужского органа
Сначала крутила пальцем у виска, когда узнала, что муж использует интим крем. Потом поняла, что он старается для меня и стала относиться к подобным тренировкам положительно. Говорит что до Титана его параметры доходили до 13 на максимальной эрекции. После нескольких курсов он подрос до 17. Мы прикинули, что дальше мазать не стоит и такого результата достаточно для хорошей интимной жизни.
Народные средства для увеличения члена получили широкое распространение и в наши дни. . Конечно, существенно увеличить длину или ширину мужского органа невозможно ни при использовании медицинских препаратов, ни народными. В статье описаны методы как увеличить член народными средствами и способами, без препаратов и лекарств. Разобраны подручные, домашние средства для увеличения пениса, а так же рассмотрен дедовский метод, без лекарств и химии. 3 Применение соды для увеличения мужского достоинства. 4 Другие натуральные средства. 5 Массаж для увеличения полового органа. 6 Меры предосторожности. Фитотерапия. При упоминании народных средств многие люди сразу думают о фитотерапии. Действительно, такой метод может помочь осуществить. Специальные упражнения для увеличения мужского органа. Самый главный способ, как можно увеличить длину и диаметр пениса – это упражнения, которые сделают клетки и ткани органа более эластичными и растяжимыми. Нередко мужчины интересуются, как увеличить половой член народными средствами. . Нередко мужчинам интересно, как увеличить член народными средствами. Отдельное место среди способов увеличения размеров пениса занимает фитотерапия. Множество веков назад люди открыли. Самые доступные и действеные народные средства для увеличения члена.  . Увеличение мужского полового члена. Народные методы, лучшие лекарства и . Если есть проблемы с детородным органом и интересует вопрос, как увеличить член без мази и других подобных средств, можно выбрать несколько. Народные средства усиливают кровообращение в мужском половом органе, улучшают эрекцию и постепенно растягивают ткани пениса. . Методы народной медицины являются очень эффективными в увеличении мужского полового органа. Правильно их применив, можно довольно быстро ощутить. Методы увеличения члена народными методами. В той или иной степени большую часть мужского населения волнует вопрос: как увеличить . Народные средства для увеличения полового члена качественно отличаются от тех, что предлагаются производителями различных препаратов и специальных. УРОЛОГИЯ. Увеличение члена. Как увеличить член народными средствами: что выбирают люди? link. . Признаны одним из самых эффективных вариаций по утолщению органа. Разминая пустотные области руками, можно контролировать степень давления на эти анатомические структуры. Не только операция может помочь сделать член на несколько сантиметров длиннее. С этой задачей справляются и более консервативные методы. Мало кто знает, что увеличить член можно в домашних условиях.

заявлений о здоровье | Звездочка: друг или враг?

Скромная звездочка (*) имеет множество применений, одно из которых — перенаправлять читателей к другой части текста, где они могут быть дополнительной информацией. Однако когда дело доходит до упаковки пищевых продуктов, она может принимать менее нейтральное и более неблагоприятное значение.

Почему рядом с заявлением о состоянии здоровья стоит звездочка?

, имеют очень конкретную формулировку, но пищевые компании могут изменять формулировку, чтобы ее было легче понять для потребителей (см. Регламент заявлений ЕС о вреде для здоровья ). ¹ Однако часто от них по-прежнему требуется поместить исходную формулировку EFSA где-нибудь на упаковке — и они часто связывают их, используя звездочку или подобное устройство (например, число в надстрочном индексе), чтобы указать, что есть сноска. в другом месте на этикетке. Все звучит довольно невинно, правда?

Что вы думаете, когда видите звездочку?

В Университете Рединга мы проводили фокус-группы, чтобы выяснить, как потребители интерпретируют информацию, которую они видят на этикетках пищевых продуктов, и это исследование показывает, что многие потребители могут иметь некоторые сомнения, когда видят звездочку.Представьте, что вы видите это на своей продуктовой упаковке:

Этот продукт помогает поддерживать бдительность.

А теперь сравните с этим:

Этот продукт помогает поддерживать бдительность *

Похоже, что многие люди посмотрят на вторую, заметят звездочку, предположат, что это означает «отказ от ответственности» или «предостережение», а затем не будут следить за ней, чтобы увидеть, что в ней написано. А это означает, что они с меньшей вероятностью поверят заявлению, хотя на самом деле это ссылка на информацию, которая должна сделать его еще более правдоподобным: формулировка, одобренная EFSA.

С другой стороны, возможно, одобренная EFSA формулировка должна быть более очевидной. Во многих случаях звездочка ведет к очень неясной части пакета, где ее очень трудно найти, даже если вы ее ищете!

Итак …

В следующий раз, когда вы увидите заявление о состоянии здоровья, за которым стоит звездочка, посмотрите, сможете ли вы найти, к чему это ведет. Достаточно ли легко найти? Кажется ли это вам более правдоподобным?

Расскажите нам о своем опыте в комментариях ниже!

Эта статья адаптирована автором для FoodUnfolded.Оригинальную статью можно найти здесь.

использований мази такролимуса. Такролимус при экземе

О мази такролимуса

Мазь такролимус помогает уменьшить воспалительные кожные реакции. Его назначают людям с экземой средней и тяжелой степени, обычно в качестве альтернативы другим методам лечения, таким как стероидные кремы или мази. Его наносят наружно (на кожу), чтобы уменьшить такие симптомы, как воспаление, покраснение и зуд. Мазь такролимуса доступна в двух дозах: 0,03% и 0,1%. Только нижний, 0,03%, подходит для использования детьми. Первоначально его назначит врач-кожевник.

Такролимус также доступен в виде лекарства, которое принимают внутрь, но его назначают при совершенно другом заболевании.Об этом есть отдельная брошюра под названием Такролимус для предотвращения отторжения органов .

Перед использованием мази такролимуса

Некоторые лекарства не подходят для людей с определенными состояниями, и иногда лекарство можно использовать только при соблюдении особой осторожности. По этим причинам, прежде чем вы начнете использовать мазь такролимуса, важно, чтобы ваш врач знал:

• Если вы беременны, пытаетесь родить ребенка или кормите грудью.
• Если у вас есть другие кожные заболевания.
• Если у вас опухшие лимфатические узлы или ослабленная иммунная система.
• Если у вас проблемы с работой печени.
• Если у вас когда-либо была аллергическая реакция на лекарство, особенно если это был антибиотик из группы макролидов (например, эритромицин, кларитромицин, азитромицин или телитромицин).
• Если вы принимаете или принимаете какие-либо другие лекарства. Сюда входят любые принимаемые вами лекарства, которые можно купить без рецепта, а также лекарственные травы и дополнительные лекарства.

Как пользоваться мазью такролимуса

• Перед тем, как начать лечение, прочтите распечатанный информационный буклет производителя изнутри упаковки. Он предоставит вам больше информации о мази и предоставит вам полный список побочных эффектов, которые могут возникнуть при ее использовании.
• Наносите мазь тонким слоем на часто пораженные участки кожи два раза в день (обычно рекомендуется наносить мазь утром и вечером). Его можно наносить на большинство участков кожи на теле, но не наносите его на такие участки, как губы, внутренняя часть носа или рядом с глазами.Не наносите его на участки кожи, которые могут быть инфицированы. Не забудьте хорошо вымыть руки после использования мази, если вы не обрабатываете руки.
• Если вы забыли нанести мазь, нанесите ее, как только вспомните, а затем продолжайте, как прежде.

Получение максимальной отдачи от лечения

• Постарайтесь регулярно посещать врача. Это нужно для того, чтобы врач мог следить за вашим прогрессом.
• Продолжайте использовать мазь, пока экзема не пройдет.Вы должны ожидать улучшения состояния вашей кожи в течение одной недели после использования мази, и на ней не должно быть обострений в течение еще нескольких недель. В течение этого времени ваш врач может попросить вас уменьшить частоту нанесения мази или может уменьшить силу мази, которую вы используете.
• Мазь Такролимус предназначена для кратковременного применения (до шести недель). Его не следует использовать каждый день в течение длительного периода времени. Некоторым людям, у которых часто бывают обострения, можно прописать мазь для использования два дня в неделю, чтобы предотвратить дальнейшее развитие обострений.Когда он используется таким образом, чтобы предотвратить обострение, между нанесениями должно быть не менее 2-3 дней.
• Вы ​​можете продолжать использовать увлажняющие кремы и лосьоны во время лечения такролимусом, но вам следует подождать не менее двух часов после нанесения мази такролимуса, прежде чем наносить их.
• Важно, чтобы вы не закрывали участки кожи, обработанные такролимусом, повязками или повязками. Это связано с тем, что ваша кожа может абсорбировать больше лекарства, чем предполагалось.
• Не употребляйте алкоголь, потому что он может вызвать покраснение кожи и лица, а также ощущение жара.
• Ваш врач обсудит с вами возможность немного повышенного риска рака (особенно рака кожи), связанного с такими лекарствами, как такролимус. Чтобы снизить этот риск, не используйте шезлонги и избегайте сильного солнечного света. В яркие дни, даже в пасмурную погоду, используйте солнцезащитный крем с высоким солнцезащитным фактором (SPF не менее 15).
• Если после использования мази такролимуса в течение двух недель улучшения состояния кожи не наблюдается, вам следует снова обратиться к врачу для получения дополнительных рекомендаций.

Может ли мазь такролимуса вызывать проблемы?

Помимо своих полезных эффектов, большинство лекарств может вызывать нежелательные побочные эффекты, хотя не у всех они возникают. В таблице ниже приведены некоторые из наиболее распространенных из них, связанных с мазью такролимуса. Вы найдете полный список в информационном буклете производителя, который прилагается к вашему лекарству. Нежелательные эффекты часто улучшаются по мере того, как ваше тело приспосабливается к новому лекарству, но поговорите со своим врачом или фармацевтом, если что-либо из следующего продолжается или становится неприятным.

Если вы испытываете какие-либо другие симптомы, которые, по вашему мнению, могут быть связаны с применением мази, проконсультируйтесь со своим врачом или фармацевтом.

Как хранить мазь такролимуса

• Храните все лекарства в недоступном для детей месте.
• Хранить в прохладном, сухом месте, вдали от прямых источников тепла и света.

Важная информация обо всех лекарствах

Звездочка в журналах записей MLB была неправильной тогда и все еще неправильна | Отчет отбеливателя

Если кто-то смотрел фильм 61 * , вы знаете, что в бейсболе многие годы решили пометить смерть Рут Роджером Марисом звездочкой. Причина комиссара заключалась в том, что Марис сыграл больше игр, чем Рут, поэтому это не равный результат.

Это была огромная ошибка. Тот, который, на мой взгляд, испортил бейсбол, потому что Марис не был мальчиком с плаката, которого все любили, как более приветливого Бэйба.

В 1990-е годы мы знаем, что эра стероидов в бейсболе была в самом разгаре. Сколько длилась эта эпоха, остается только догадываться. Это известный факт, что стероиды использовались в футболе в 1970-х годах, поэтому даже тогда они были доступны для звездных игроков.

Мы также знаем, что амфетаминами злоупотребляли еще дольше в Высшей лиге бейсбола. Возможно, это восходит к эпохе Мариса.

Некоторые считают, что любые записи подтвержденного употребления стероидов или гормона роста человека должны быть удалены из книги записей. Это было бы похоже на то, что делали на Олимпийских играх, где также применялось наказание с обратной силой.

Другие хотели бы видеть звездочки с именами этой эпохи. Обозначая тот факт, что у них было профессиональное преимущество.

Но какой от звездочки? Что дает стирание имен с книг?

Барри Бондс все же сделал 72 хоумрана и побил рекорд Хэнка Аарона, используя клир и сливки. Алекс Родригес ввел себя в некоторые доминиканские специальные предложения и, вероятно, побьет небывалый рекорд Бонда в области хоумрана.

Тем не менее, одержимость цифрами в бейсболе и восприятие чистых рекордов — заблуждение. Бейсбол имеет прекрасную традицию обмана.

Спитболлы, пробковые летучие мыши и лекарственные помощники не были изобретениями той эпохи.На мой взгляд, эта эпоха мало чем отличается от других в этом отношении.

Если мы хотим обозначить причину большого количества людей в эту эпоху, у меня нет проблем с этим. Однако не будем обманывать себя, ведь мы не знаем, была ли эпоха Руфи чище.

Я подозреваю, что если бы в то время были стероиды, они бы использовались, так же как и другие разновидности и другие методы были бы использованы для получения преимущества.

Итак, нет, звездочка не поможет вытереть пятно от стероидов.В будущем использование одного из них может выглядеть таким же глупым, как то, что было поставлено на Марис.

Лечение псориаза siRNA NFKBIZ с использованием местных ионных жидких составов

Abstract

Системные антитела, направленные на фактор некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкин-17A (IL-17A), эффективны при псориазе бляшек. Несмотря на их популярность, проблемы безопасности представляют собой проблему для системных биопрепаратов. В то время как антитела против TNF-α и против IL-17A эффективно ингибируют соответствующие белки, мы предполагаем, что подход, основанный на локальном молчании вышележащей мишени, такой как NFKBIZ, может быть полезным для лечения псориаза.Однако эффективная доставка малых мешающих РНК (миРНК) в кожу является серьезным препятствием из-за барьерной функции кожи и низкой стабильности миРНК. Используя ионные жидкости в качестве вспомогательной технологии, мы сообщаем об эффективной доставке миРНК NFKBIZ в кожу и ее терапевтической эффективности на модели псориаза. Обработка IL-siRNA подавляла аберрантную экспрессию гена и приводила к подавлению сигналов, связанных с псориазом, включая TNF-α и IL-17A. Эти результаты обеспечивают основу для платформы для местной доставки siRNA.

ВВЕДЕНИЕ

Псориаз — одно из наиболее изнурительных хронических кожных заболеваний, от которого страдают более 125 миллионов человек во всем мире, экономическое бремя которого в США оценивается в 135 миллиардов долларов в год ( 1 ). Его патогенез и лежащие в основе механизмы до сих пор полностью не изучены. Ядерный фактор κB (NF-κB), повсеместно экспрессируемый фактор транскрипции, считается главным регулятором иммунных ответов и участвует в нескольких аутоиммунных воспалительных заболеваниях, включая псориаз ( 2 ).В клинике доступно несколько терапевтических средств, нацеленных на сигнальные пути NF-κB; тем не менее, опасения относительно отсутствия специфичности и побочных эффектов создают проблему ( 3 ). Это особенно сложно, поскольку системное ингибирование плеотропных белков, таких как NF-κB, может приводить к серьезным побочным эффектам, поскольку они обеспечивают необходимую базальную активность в качестве факторов выживания. Сетецентрические подходы, включающие ингибиторы, специфичные для пути, вызывают значительный терапевтический интерес ( 4 ).В связи с этим инфликсимаб и адалимумаб [оба моноклональных антитела к фактору некроза опухолей — α (TNF-α)], а также секукинумаб [антитела к интерлейкину-17A (IL-17A)] были одобрены Управлением по контролю за продуктами питания и США. Администрация лекарственных средств и, как утверждается, опосредуют их терапевтические эффекты посредством модуляции активности NF-κB ( 5 ).

NFKBIZ, ген, кодирующий атипичный ингибитор ядерного фактора κB (IκB), белок IκBζ, заинтересовал в терапевтическом вмешательстве из-за его решающей роли в регуляции комплексов NF-κB ( 6 , 7 ).Сообщается, что он является прямым активатором транскрипции TNF-α–, IL-17A– и IL-36-индуцибельных генных продуктов, связанных с псориазом, которые участвуют в воспалительной передаче сигналов, хемотаксисе нейтрофилов и активации лейкоцитов ( 8 — 11 ). Кроме того, сильная экспрессия NFKBIZ у пациентов с псориазом может быть коррелирована с повышенными реакциями IL-36- и IL-17A-типа ( 12 ). Локальное подавление NFKBIZ может быть выгодным, поскольку потенциально может расширить популяцию пациентов, которым может быть полезно лечение, по сравнению с лечением одним антителом.

Подавление NFKBIZ за счет местного применения малой интерферирующей РНК (siRNA) предлагает неинвазивный вариант самостоятельного лечения с минимальными побочными эффектами ( 13 ). Однако самая большая проблема этого пути состоит в том, что для успешной местной доставки можно использовать только ограниченное количество лекарств с низкой молекулярной массой (до нескольких сотен дальтон) и высокими коэффициентами распределения октанол-вода ( 14 ). Трансдермальная и местная доставка гидрофильных молекул, особенно макромолекул, таких как антитела и нуклеиновые кислоты, остается сложной задачей из-за их высокой молекулярной массы ( 15 ). Несколько отчетов продемонстрировали местную доставку siRNA с использованием таких методов, как сферические нуклеиновые кислоты ( 16 ) и самособирающиеся каркасные нуклеиновые кислоты ( 17 ). Микроиглы также были исследованы для местной доставки миРНК ( 18 ). Также были изучены такие методы, как электропорация ( 19 ) и пептидные носители ( 20 — 22 ). Также были разработаны стратегии доставки миРНК для лечения кожных ран ( 23 , 24 ).Недавно ионные жидкости (ИЖ) появились как класс универсальных материалов для местного и трансдермального введения ( 25 ). IL предоставляют ряд потенциальных преимуществ, включая возможность настройки, широкую применимость и отличный профиль безопасности ( 26 ). IL продемонстрировали потенциал для доставки миРНК, но их способность вызывать терапевтический эффект путем подавления молчания мишени in vivo не была продемонстрирована.

Здесь мы сообщаем о модульном подходе к доставке siRNA на основе IL для подавления различных интересующих генов. В частности, мы идентифицировали комбинацию IL, которая одновременно стабилизирует миРНК и усиливает проникновение миРНК в кожу после местного применения. Мы демонстрируем эффективность препарата в подавлении NFKBIZ in vivo на мышиной модели псориаза, индуцированного имиквимодом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выбор IL

Библиотека IL была разработана и синтезирована для оценки доставки siRNA в кожу. Холиний использовался в качестве катиона во всех ИЖ из-за его известной биосовместимости и предыдущего использования на людях ( 27 ).Для синтеза ИЖ использовали несколько различных анионов (рис. S1). Гераниновая кислота использовалась в качестве эталонного аниона в библиотеке IL [то есть холин и герановая кислота (CAGE) в качестве эталонной IL] из-за ее предшествующего использования для трансдермальной доставки макромолекул ( 28 — 30 ). Другие анионы были выбраны по нескольким причинам. Во-первых, были выбраны анионы, содержащие более короткие линейные углеродные цепи, в отличие от гераниевой кислоты, чтобы оценить влияние длины цепи на стабильность и доставку миРНК. Анионы с ароматическими группами были выбраны, так как они могут взаимодействовать со сложенными парами оснований РНК посредством электростатических, гидрофобных и полярных взаимодействий. Все IL были получены при стехиометрическом соотношении 1: 2 (катион: анион) и были оценены на стабильность и доставку siRNA. Из синтезированных ИЖ CAGE, холин и диметилакриловая кислота (CADA), холин и изовалериановая кислота (CAVA), а также холин и фенилпропановая кислота (CAPA) остались в виде вязкой жидкости при комнатной температуре (RT), тогда как холин и 4-фенолсульфоновая кислота (CASA), холин и фенилфосфорная кислота (CAPP), а также холин и бифенил-3-карбоновая кислота (CABA) затвердели или образовали гель (рис.S1). Типичные спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) ¹ H можно найти на рис. S1, что подтверждает успешный синтез и чистоту ИЖ. Кроме того, поскольку как интерлейкин, так и IL были обозначены как «IL», для ясности, все интерлейкины обозначаются числовыми значениями по всей рукописи.

Влияние IL на стабильность siRNA

Сначала мы оценили влияние IL на стабильность siRNA. Спектроскопия кругового дихроизма (КД) миРНК, инкубированных с водными растворами индивидуальных ИЖ при концентрации 50% (об. / Об.), Выявила заметные изменения в основной цепи α-спирали (подтвержденные отрицательной полосой при 210 нм) в присутствии CAGE, CADA, и CABA.С другой стороны, CAVA и CAPA сохранили вторичную структуру siRNA (рис. 1A). Полосы, полученные в результате электрофореза в нативном геле, дополнены результатами CD (рис. 1B). Повышенная стабильность siRNA в присутствии CAPA предполагает возможность синергетических эффектов между IL, полученными из двух структурно различных анионов. Следовательно, мы оценили влияние смесей IL на стабильность siRNA, чтобы определить, может ли совместимость CAPA с siRNA обеспечить дополнительную защиту от неблагоприятного воздействия CAGE и CABA на структуру siRNA.Комбинация CAGE (25% об. / Об.) И CAPA (25% об. / Об.) Привела к заметной полосе, указывающей на сохранение структуры siRNA (фиг. S1).

( A ) Спектры КД миРНК в фосфатно-солевом буфере (PBS) после инкубации с IL (50% об. / Об.) В течение 30 мин и диализа в течение 72 часов. ( B ) Типичное изображение нативного геля миРНК после инкубации IL. bp, пара оснований.( C ) Репрезентативные конфокальные изображения siRNA (красный цвет) в различных слоях кожи (а) роговой слой (SC), (b) эпидермис и (c) дерма, в присутствии комбинации IL (CAGE + CAPA), смешанные в соотношении 1: 1 через 24 часа инкубации. Слева направо: объединенный, Cy5, дифференциальный интерференционный контраст (ДИК). Масштабные линейки 50 мкм. ( D и E ) Транспорт меченой Cy5 siRNA в присутствии индивидуальных IL с концентрацией 50% (об. / Об.) (D) и комбинацией 50% (об. / Об.) (E) IL в различные слои кожи, определенные методом снятия ленты ( n = 3). Данные представляют собой средние значения ± SEM и были определены как непараметрические с помощью теста нормальности и статистики с помощью теста Краскала-Уоллиса для (D) и (E). * P <0,05.

Скрининг оптимальных комбинаций IL для доставки siRNA

Затем отдельные IL и их комбинации оценивали на эпидермальное проникновение Cy5-меченной siRNA в кожу свиньи в диффузионных клетках Франца (FDC) (рис. 1C). Некоторый эпидермальный захват голой миРНК наблюдался в контроле. CAGE продемонстрировал самую высокую доставку среди всех протестированных IL (рис.1D). Примерно 0,20 нмоль / см ² миРНК было доставлено в эпидермис в присутствии CAGE (50% об. / Об.) По сравнению с 0,07 нмоль / см ² в случае голой миРНК. Поскольку 50% CAGE потенциально влияли на структуру siRNA, мы также измерили способность комбинаций IL доставлять siRNA в кожу. Комбинация CAPA и CAGE (25% об. / Об. Каждый) привела к доставке в кожу ~ 0,4 нмоль / см ² siRNA (рис. 1E). Поскольку комбинация CAGE + CAPA обеспечила наивысшую эпидермальную доставку, а также высокую стабильность, она была выбрана в качестве ведущего препарата для дальнейших исследований (рис.S2).

IL-индуцированные эффекты интеркаляции и сольватации на РНК.

Моделирование молекулярной динамики (MD) было выполнено для изучения механизма, с помощью которого комбинация IL (CAGE + CAPA) стабилизирует РНК. Из снимков элементарных клеток в пределах 10 Å от РНК очевидно, что герановая кислота в CAGE отвечает за формирование агрегированных сгустков, что приводит к отделению гераниевой кислоты от холина, воды и молекулы РНК (рис. 2, A и B). . Добавление фенилпропановой кислоты к CAGE привело к более стабильному распределению трех молекулярных частиц / ионов в растворе IL (рис.2, В и Г). Кроме того, близость молекул фенилпропановой кислоты к молекулам РНК, возможно, из-за присутствия гидрофобных ароматических колец в отличие от ее алифатического аналога (герановой кислоты), подтверждает ее решающую роль в интеркалировании между сложенными парами оснований РНК, способствующими сольватации и стабильности РНК .

( A и B ) Снимок моделируемой элементарной ячейки для компонентов CAGE и siRNA (A) и CAGE, обнаруженных в пределах 10 Å от siRNA (B) при периодических граничных условиях в течение 500 нс.( C и D ) Снимок моделируемой элементарной ячейки для оптимизированной комбинации IL (CAGE и CAPA, 1: 1) и видов миРНК (C) и IL, обнаруженных в пределах 10 Å от миРНК (B) в аналогичных условиях. ( E и F ) Радиус гирации (RGYR) (E) и среднеквадратичное отклонение (RMSD) (F), полученные в течение 500 нс для CAPA и комбинации IL (CAGE и CAPA) в отличие от КЕЙДЖ (контроль).

Структурные свойства РНК оценивались путем моделирования в течение 500 нс и измерения среднеквадратичного отклонения (RMSD) и радиуса инерции (RGYR).RGYR, полученный для группы CAGE, был постоянным до 150 нс и начал уменьшаться к концу моделирования, что указывает на непоследовательную компактность системы (рис. 2E). Напротив, увеличенный и постоянный RGYR, полученный для комбинации IL (CAGE + CAPA) в течение более 500 нс, хорошо согласуется с улучшенными результатами взаимодействия IL-РНК. Такое улучшенное взаимодействие и компактность оптимизированной системы ИЖ с РНК также можно отнести к увеличению относительной молекулярной подвижности или снижению локальной вязкости при добавлении фенилпропановой кислоты в CAGE.Кроме того, более низкая вязкость системы IL может ослабить внутримолекулярный штамм, наложенный на РНК посредством IL, и является возможным объяснением снижения RMSD, наблюдаемого в случае CAGE + CAPA (рис. 2F).

IL-опосредованная модуляция динамики липидной мембраны

Для оценки встраивания и транслокации IL в липидные бислои было проведено моделирование липидного бислоя в присутствии IL (рис. 3, от A до C). Помимо улучшения стабильности и сольватации РНК, компактная упаковка ионных частиц, приводящая к образованию агрегатов, по-видимому, усиливает взаимодействия ИЛ-липидная мембрана. Агрегаты, образованные отдельными ионными фрагментами, по-видимому, обеспечивают непрерывность между системой IL и молекулами, составляющими липидный бислой. Возможно, что коллективная масса ионных агрегатов играет решающую роль в облегчении проникновения через мембрану в дополнение к ИЖ, в частности, способность герановой кислоты извлекать или разжижать липиды, как сообщалось ранее ( 26 ).

( A ) Моделирование липидного бислоя с агрегатами холина, гераниевой кислоты и фенилпропановой кислоты, выделенными кружком. ( B ) Увеличенный вид ионных частиц из круга, изображающий замкнутое взаимодействие ионных частиц с головками и хвостами фосфолипидов. Агрегат содержит все три ионных частицы, участвующие во взаимодействии с липидной мембраной. ( C ) Типичный снимок, рассматриваемый перпендикулярно мембране в плоскости липидного бислоя. ( D и E ) Средняя толщина липидной мембраны (D) и средняя площадь на липид (E) в ходе моделирования в присутствии CAPA и комбинации IL (CAGE и CAPA) в отличие от CAGE ( контроль). Все данные представляют собой средние значения ± SEM и были определены как непараметрические с помощью теста нормальности и статистики с помощью теста Краскела-Уоллиса для (D) и (E). **** P <0,0001.

Относительный эффект IL, включая CAGE, CAPA и CAGE + CAPA, на динамику мембраны оценивали путем измерения средней толщины липидного бислоя в присутствии IL за время моделирования 350 нс.Наибольшая толщина наблюдалась в присутствии CAGE (50% об. / Об.), Что указывает на большую интеркаляцию IL в липидном бислое. Сходная толщина была отмечена для групп с водой и CAPA (50% об. / Об.), Тогда как CAGE (25% об. / Об.) С CAPA (25% об. / Об.) Привела к более высокой толщине (рис. 3D). Снимки МД моделирования подчеркивают динамику взаимодействий отдельных ионных частиц в ИЖ с фосфолипидной мембраной. Обнаружено окончательное интеркалирование ионных частиц комбинации ИЖ с бислоем (рис.3Б). Кроме того, визуализировав траектории отдельных ионных частиц в рамках моделирования CAGE + CAPA, мы смогли наблюдать снижение подвижности герановой кислоты по сравнению с фенилпропановой кислотой (рис. S3). При рассмотрении агрегата ИЖ, состоящего из всех трех видов ИЖ (холина, герановой кислоты и фенилпропановой кислоты), мы наблюдали, что каждая молекула гераниновой кислоты имеет тенденцию оставаться в контакте с агрегатом в течение моделирования, в то время как холин и фенилпропановая кислота кислоты способны перемещаться как между совокупностью разнородных частиц, так и основным растворителем, составляющим остальную часть системы.Это увеличение подвижности, вероятно, вызывает изменение распределения локальной вязкости в системе. При визуализации головных групп липидов, которые контактируют с агрегатом, мы наблюдаем, что головные группы занимают большую площадь на липид. Об этом свидетельствует более «разбросанное» распределение индивидуальных траекторий молекул внутри области агрегата ИЖ. Это расширение пространства между липидами вызвано интеркалированием IL с мембраной и последующим перемещением липидных частиц.Поскольку агрегация вызывает локализацию эффектов IL на двухслойной мембране, вполне вероятно, что агрегация с низким обменом компонентов с основным растворителем может привести к неравномерному разрушению мембраны, а также к различиям в локальной вязкости. Это гетерогенное распределение разрушения мембран может объяснять широкое распределение значений площади на липид, наблюдаемое в ходе моделирования в CAGE по сравнению с другими системами IL (Fig. 3E). В целом, эти результаты показывают вклад агрегированного оборота IL в транслокацию РНК через липидные бислои.

Биосовместимость IL у мышей

Оптимизированный состав CAGE + CAPA IL был оценен на токсичность in vivo на мышах. Состав миРНК IL-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (25 мкл) наносили местно в течение четырех дней подряд на кожу спины безволосых мышей элитной группы SKH-1 (SKH-1E) (рис. 4A). Признаков воспаления, покраснения и / или раздражения у животных, получавших ИЛ, не наблюдалось (фиг. S4). Затем ткань кожи собирали, вырезали срезы и окрашивали на гистопатологические и токсикологические маркеры.Группы, обработанные составом IL, не проявляли признаков утолщения эпидермиса и гиперпролиферации кератиноцитов и были эквивалентны необработанным и / или обработанным голой siRNA животным (фиг. 4B и фиг. S4). Мы также протестировали уровни экспрессии гена TNF-α у здоровых мышей. Животные, обработанные голой миРНК, были статистически эквивалентны необработанным животным. У мышей, получавших миРНК IL-GAPDH и IL-siCon (контрольная миРНК, используемая для последующих экспериментов), было обнаружено несколько меньшее количество транскриптов мРНК TNF-α по сравнению с группой, не получавшей лечения (рис.S4). Такое ингибирование экспрессии TNF-α может потенциально возникать из-за присущих свойств отдельных компонентов IL и должно быть изучено в будущих исследованиях.

( A ) Схематическое изображение расписания тематических приложений. ( B ) Репрезентативные гистологические изображения [гематоксилин и эозин (H&E)] ткани кожи через 5 дней после местного применения IL-siRNA.Масштабные линейки 100 мкм; увеличение, × 10. ( C ) Конфокальные изображения эпидермального накопления Cy5-siRNA (красный) с IL и без IL в ткани кожи мыши. Масштабные линейки 50 мкм. ( D ) Экспрессию мРНК GAPDH измеряли с помощью кПЦР. Экспрессию мРНК β-актина использовали для нормализации. Данные представляют собой средние значения ± SEM и были определены как непараметрические с помощью теста нормальности и статистики с помощью теста Краскела-Уоллиса. * P <0,05, *** P <0,001 и **** P <0.0001. ( E ) Уровни GAPDH в образцах кожи определяли с использованием иммуноферментного анализа GAPDH. Данные представляют собой средние значения ± SEM, статистику односторонним дисперсионным анализом с пост-тестом Tukey HSD. **** P <0,0001 (контроль, n = 5; голая миРНК, n = 5; IL-siCon, n = 4; IL-siRNA, n = 8). Фото: Н.К., Гарвардский университет.

Проникновение IL-siRNA и подавление GAPDH у здоровых мышей

Cy5 в эпидермисе измеряли у здоровых мышей после трансдермального применения в течение четырех последовательных дней.Конфокальные изображения выявили заметное увеличение флуоресценции Cy5 в эпидермисе для группы, получавшей ИЛ, по сравнению с голой миРНК у мышей (рис. 4С). При определении эффективности подавления гена GAPDH с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) было обнаружено, что уровни экспрессии GAPDH снизились в 4,5 и 8,6 раза для группы, обработанной IL-миРНК, в отличие от голой миРНК и необработанных мышей. соответственно (рис. 4D). Небольшое снижение экспрессии мРНК GAPDH также наблюдалось в группе, обработанной голой миРНК. Последовательно необходимо было выяснить, транслируется ли изменение экспрессии мРНК GAPDH на восстановление белка. В соответствии с результатами нокдауна гена, группа, обработанная IL-siRNA, продемонстрировала статистически значимое снижение (2-кратное) экспрессии белка GAPDH по сравнению со всеми другими группами лечения (рис. 4E). Сниженная экспрессия мРНК GAPDH для группы, обработанной голой siRNA, не подавляла экспрессию белка GAPDH.

Локальное подавление NFKBIZ в коже ингибирует псориаз, индуцированный имиквимодом

Способность миРНК NFKBIZ лечить псориаз была протестирована с использованием CAGE + CAPA в качестве препарата для местного применения.После индукции псориаза и местного нанесения композиции миРНК IL-NFKBIZ (фиг. 5A) ткань кожи собирали и анализировали. Макроскопически местный нокдаун NFKBIZ в дорсальной коже заметно уменьшал вызванное имиквимодом воспаление, показывая уменьшение эритемы и шелушения в области, где применялась миРНК IL-NFKBIZ по сравнению с группами, не получавшими лечения, обработанными IL и обработанными IL-siCon (рис. 5B и рис. S5). Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) срезов кожи мышей показало, что нокдаун NFKBIZ с помощью IL-siRNA снижает утолщение эпидермиса, акантоз, гиперкератоз и булавовидные сетчатые гребни (рис.5C и фиг. S5). Аналогичным образом, иммуногистохимический (ИГХ) анализ выявил гиперпролиферацию кератиноцитов в необработанных, обработанных IL и обработанных IL-siCon группах, тогда как в группе, обработанной IL-NFKBIZ siRNA, обнаружено отсутствие пролиферации кератиноцитов (окрашивание Ki67) (рис. 5D и рис. S5). Общие характерные признаки воспаления кожи, вызванного имиквимодом (эритема и шелушение), оценивали ежедневно в течение периода индукции / применения. Индивидуальные оценки эритемы и шелушения продемонстрировали достоверное снижение, начиная с 3-го дня при местном нанесении IL-siRNA (рис.5, E и F). Максимальные совокупные баллы были получены для групп, не получавших лечения, и групп, получавших ИЛ, и были заметно снижены в группе, получавшей ИЛ-миРНК (рис. S6). Двойная толщина кожной складки (DSFT) для измерения толщины кожи не выявила существенных различий между группами (рис. S6). Кроме того, тепловая карта и анализ мРНК показали значительное снижение экспрессии NFKBIZ и других продуктов генов, связанных с псориазом (рис. S7) по сравнению с группами, не получавшими лечения и получавшими IL-siCon (рис.5, от G до J и рис. S8). После обработки IL-siCon активировалось большинство генов, включая NFKBIZ, TNF-α, цитокины (IL-17C, IL-19, IL-22, IL-36A и IL-36G), хемокины (CCL20) и антимикробные белки (LCN2 и DEFB4) (рис. 5G). Некоторое подавление экспрессии мРНК TNF-α и IL-17A наблюдалось у здоровых мышей при лечении одним IL (рис. 5, I и J) и предполагает дополнительные свойства, присущие IL, которые могут быть изучены в будущих исследованиях. Дальнейшие исследования также должны быть сосредоточены на определении кривой доза-ответ терапевтического эффекта siRNA-IL.

( A ) Схематическое изображение схемы нанесения для индукции заболевания и местного введения IL-siRNA. ( B ) Мышей с индуцированным псориазом лечили местно миРНК IL-NFKBIZ и сравнивали с группами, не получавшими лечения, и группами, которым вводили IL. ( C ) Окрашивание H&E срезов кожи, вызванных псориазом, у мышей с лечением и без лечения.Масштабные линейки 50 мкм; увеличение, × 10. ( D ) Срезы кожи мышей анализировали на пролиферацию кератиноцитов (маркер пролиферации, Ki67) с помощью ИГХ. Масштабные линейки, 100 мкм. ( E и F ) Показатели эритемы и шкалы, полученные путем слепой оценки с использованием системы оценки PASI человека ежедневно по шкале от 0 (нет изменений) до 4 (очень отчетливые изменения). ( G ) Тепловая карта уровней экспрессии различных генов, связанных с псориазом, после обработки миРНК IL-NFKBIZ по сравнению с необработанной (контроль) и обработанной IL-siCon группами. Уровни экспрессии мРНК (от H до J ) измеряли с помощью кПЦР, и экспрессию мРНК β-актина использовали для нормализации для NFKBIZ, TNF-α и IL-17A, соответственно. Данные представляют собой средние значения ± SEM, статистику односторонним дисперсионным анализом с пост-тестом Tukey HSD. * P <0,05, ** P <0,01 и **** P <0,0001 (контроль, n = 4; IL, n = 4; IL-siCon, n = 4; IL-siRNA, n = 8). Фотография: (B) A.M., Гарвардский университет; (C и D) Н.K.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ограниченное понимание основных регуляторов воспалительных сигнальных путей и хронологического порядка лежащих в основе механизмов представляет собой проблему при лечении псориаза. Недавно было обнаружено, что сигнальные пути, включая NF-κB, киназу Януса (JAK) / преобразователь сигнала и активатор транскрипции (STAT) и митоген-активируемую протеинкиназу p38, играют важную роль в патогенезе этого сложного заболевания ( 31 ). NFKBIZ, ген, кодирующий IκBζ, является важным транскрипционным коактиватором, опосредующим последующие эффекты ряда специфических воспалительных цитокинов, и особенно важен в свете недавних открытий Johansen et al. ( 6 ) и Мюллер и др. ( 12 ), что указывает на то, что IκBζ является ключевым модулятором IL-17A, IL-23 и IL-36 ( 32 ). Таким образом, нацеливание на NFKBIZ / IκBζ для ингибирования провоспалительных сигнальных путей и выработки продуктов генов, связанных с псориазом, является жизнеспособной стратегией лечения псориаза. Клинически антитела, нацеленные на TNF-α и IL-17A, показали многообещающие результаты в достижении первичных конечных точек и улучшении болезненного состояния ( 33 ). Однако, как биологические препараты, эти антитела имеют проблемы потенциальной системной токсичности, образования анти-антител и высокой стоимости.

Здесь мы представляем комбинацию IL, способную улучшать накопление в эпидермисе и доставку РНК через кожу. Мы предположили, что комбинация IL стабилизирует siRNA и, в то же время, улучшит ее проникновение. Мы подтвердили эту гипотезу на модели вызванного имиквимодом псориазоподобного воспаления кожи, которое напоминает псориаз бляшечного типа у людей. Местное применение IL-siRNA в течение четырех дней подряд приводило к существенному снижению уровней воспалительных цитокинов и ряда продуктов генов, связанных с псориазом.

Состав CAGE + CAPA IL имеет ряд преимуществ по сравнению с другими системами трансдермальной доставки лекарств. Компоненты состава ИЖ, бикарбонат холина, гераниновая кислота и фенилпропановая кислота, оказались безопасными или признанными безопасными химическими веществами GRAS и обеспечивают прочную основу для безопасности ИЖ. Кроме того, простые процессы синтеза и масштабирования, высокая сольватирующая способность и возможность настройки предлагают дополнительные преимущества по сравнению с другими летучими органическими растворителями. Эта система особенно подходит для трансдермальной доставки нуклеиновых кислот благодаря как своей сложной интеркаляции между сложенными парами оснований РНК и ароматическими кольцами IL, так и усиленному взаимодействию с липидным бислоем.

Наши результаты показывают, что ИЖ могут образовывать комплекс с нуклеиновыми кислотами без ущерба для биоактивности, что делает их идеальными для трансдермальной доставки лекарств. Солевой метатезис или реакция анионного обмена для синтеза IL особенно выгодны, поскольку не требуют интеграции агрессивных органических растворителей для доставки siRNA. Отдельные компоненты IL можно модулировать для взаимодействия практически с любой нуклеиновой кислотой на основе характеристик связывания и молекулярного механизма взаимодействий.

Настраиваемая стехиометрия ионов и физико-химические свойства — другие ключевые особенности систем на основе ИЖ. Предыдущая работа в нашей группе показала роль межионных взаимодействий в сольватации и распределении активного ингредиента в коже ( 34 ). Кроме того, Chandran et al. ( 35 ) продемонстрировали важность электростатических взаимодействий и ассоциаций связывания бороздок IL для стабильности ДНК. До сих пор роль IL в улучшении стабильности и сольватации siRNA не была полностью изучена. Мы систематически варьировали анионный компонент ИЖ, имеющий структурное сходство с герановой кислотой и / или содержащий ароматическое кольцо при стехиометрическом соотношении 1: 2, и разработали собственную библиотеку ИЖ на основе холиния. Мы наблюдали, что анионы ИЖ, которые содержат ароматические кольца, обычно затвердевают или образуют гель при комнатной температуре, за исключением фенилпропановой кислоты. Превосходная стабильность siRNA наблюдалась в присутствии CAVA, CAPA и CAGE + CAPA по сравнению с другими IL и комбинациями, возможно, из-за превосходного взаимодействия с siRNA.Комбинация IL CAGE + CAPA вызвала наибольшее накопление siRNA в эпидермисе, заметно выше, чем любые отдельные IL и / или комбинация.

Наиболее эффективная комбинация ИЖ, которую мы определили в этом исследовании, CAGE + CAPA, продемонстрировала последовательное распределение трех ионных частиц с помощью МД-моделирования, что указывает на улучшенную молекулярную подвижность и более низкую вязкость, способствующую усилению эффектов сольватации. Кроме того, снимки МД-моделирования выявили тесную ассоциацию фенилпропановой кислоты с молекулами РНК, что, возможно, может быть связано с комбинацией гидрофобных и полярных взаимодействий, π-π-стэкинга и / или интеркаляции между уложенными парами оснований РНК, что приводит к повышенной стабильности РНК. .Измерения RGYR и RMSD, полученные в результате моделирования в течение 500 нс, дополнительно подтвердили улучшение взаимодействия IL-РНК.

Также важно понимать величину IL-опосредованной модуляции липидного бислоя. Моделирование методом МД выявило решающую роль агрегации ионных частиц в улучшении проницаемости мембраны с максимальной толщиной бислоя, полученной для CAGE (50% об. / Об.) С последующим CAGE + CAPA. Такие наблюдения из моделирования дополнительно устанавливают, что герановая кислота является основным двигателем транслокации комбинации IL через липидные бислои, что согласуется с экспериментальными результатами.Хотя кажется, что фенилпропановая кислота играет незначительную роль в улучшении проницаемости бислоя за счет снижения локальной вязкости всей системы ИЖ, мы полагаем, что она также отвечает за разжижение мембраны с образованием динамических пор. Ранее сообщалось, что депротонированные ароматические карбоновые кислоты, такие как фенилпропановая кислота, проникают в бислои на несколько порядков быстрее, чем это ожидалось из гипотезы распределения pH, и их проникновение полностью контролируется анионами при физиологическом pH ( 36 ).На основании этих результатов мы предполагаем, что эти IL помогают преодолевать клеточные барьеры и доставлять siRNA в цитозольные компартменты.

Для оценки биосовместимости CAGE + CAPA мы провели гистологическую оценку кожи на пятый день, который совпал с общей продолжительностью местного применения. Мы не наблюдали никаких макроскопических изменений в структуре кожи, утолщении эпидермиса и пролиферации кератиноцитов в группах, получавших ИЛ. Дальнейшее исследование уровней воспалительных цитокинов не выявило какого-либо статистически значимого увеличения мРНК TNF-α по сравнению с группами, не получавшими лечения.Некоторые из групп, получавших ИЛ, продемонстрировали снижение уровней мРНК TNF-α, что, возможно, могло быть связано с присутствием ИЛ и требует дальнейшего изучения. Заметное ингибирование экспрессии мРНК и белка GAPDH наблюдалось в группах, получавших миРНК IL-GAPDH.

Ранее было продемонстрировано, что NFKBIZ играет решающую роль в транскрипции генов нескольких провоспалительных цитокинов и антимикробных пептидов, ответственных за патогенез псориаза ( 6 , 12 ).Используя модель псориаза, индуцированного имиквимодом, мы также продемонстрировали, что локальное подавление NFKBIZ после местного нанесения состава миРНК IL-NFKBIZ нарушает экспрессию связанных с псориазом генных продуктов в условиях in vivo. У мышей, получавших ИЛ-миРНК, наблюдалось значительно меньшее количество патологий кожи, включая уменьшение эритемы и шелушения, меньшее утолщение эпидермиса и пролиферацию кератиноцитов. Локальное повышение уровней мРНК некоторых воспалительных цитокинов и продуктов родственных генов для групп, получавших IL-siCon– и IL, по сравнению с группой, не получавшей лечения, можно отнести к имиквимоду.Локальное подавление NFKBIZ привело к сильному ингибированию критических уровней мРНК провоспалительных цитокинов, включая IL-17A, IL-23 и IL-36. Последующие эффекты локального сайленсинга NFKBIZ также были подтверждены и согласуются с ранее сообщенными эффектами внутрикожной инъекции миРНК IκBζ ( 6 ). Поскольку кожа мышей обычно намного более проницаема, чем кожа человека, подробные исследования количественной оценки проникновения через кожу не проводились in vivo.

Таким образом, мы разработали платформу трансдермального IL, способную доставлять РНК в эпидермис, и объединили эту структуру с набором скрининга генов для поддержки NFKBIZ в качестве ключевого гена-мишени для передачи сигналов при лечении псориаза.Состав IL сохранил биоактивность siRNA и вызывал заметное аннулирование целевого гена при местном применении в модели индуцированного имиквимодом псориазоподобного воспаления кожи. Оптимизированный состав IL не показал токсичности и приемлем для повторного применения. Эта платформа подходит для широкого применения нуклеиновых кислот и может быть легко изготовлена ​​и расширена. Эта платформа может расширить возможности трансдермальной доставки лекарств для лечения дерматологических состояний и помочь повысить долгосрочную терапевтическую эффективность за счет воздействия на такие распространенные медиаторы. После дальнейших исследований, сфокусированных на оценке на крупных животных и сравнении с клиническими стандартами лечения, описанный здесь метод открывает потенциальный вариант лечения псориаза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проникающие через кожу комплексы ИЛ-РНК

Библиотеку ИЛ на основе холиния синтезировали, как описано ранее ( 26 ). Вкратце, катион, бикарбонат холина и различные анионы смешивали в соотношении 1: 2 для получения IL после реакции солевого метатезиса.Анионы растворяли в минимальном объеме сверхчистой воды или этанола / метанола в зависимости от растворимости и подвергали взаимодействию с бикарбонатом холина при 40 ° C в течение 24 часов. Полученный раствор IL сушили с использованием роторного испарителя при 20 мбар при 60 ° C в течение 2 часов. Остаточную воду удаляли в вакуумном сушильном шкафу при 60 ° C в течение 48 часов. Вязкие при комнатной температуре ИЖ были охарактеризованы с помощью ЯМР с диметилсульфоксидом (ДМСО) –d6 на спектрометре Agilent DD2 600 МГц (дополнительные материалы и методы). ИЛ смешивали с РНК (100 мкМ) в объемном соотношении 1: 1 и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Растворы РНК-ИЛ (1 мл) подвергали диализу против 10 мМ натрий-фосфатного буфера в течение 72 часов с использованием кассет для диализа (отсечка по молекулярной массе 10000, Invitrogen). Концентрацию РНК подтверждали и нормализовали с помощью прибора NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Стабильность РНК в растворе IL определяли с помощью CD и гель-электрофореза (дополнительные материалы и методы).

МД-моделирование

МД-моделирование было выполнено с использованием пакета OpenMM MD и силовых полей AMBER ff14SB и GAFF.Трехмерные SD-файлы для каждого вида IL были загружены из PubChem и параметризованы с помощью Antechamber перед подготовкой входных топологий моделирования с помощью LEaP. Чтобы получить начальные координаты для моделирования липидной мембраны, PACKMOL был использован для создания бислоя, состоящего из 100 молекул фосфатидилхолина (POPC) для каждой из створок. Оставшееся содержимое куба 60 Å состояло из воды (TIP3P) и IL ~ 1: 1, заряд сбалансирован Na ⁺ и Cl ^— . Моделирование продолжалось 500 нс для каждой из систем при периодических граничных условиях.Для моделирования siRNA спиральная стартовая структура для нуклеиновой кислоты была создана с помощью Avogadro ( 37 ) перед помещением в ящик для моделирования, состоящий из воды и IL ~ 1: 1 для моделирования при периодических граничных условиях в течение 350 нс. Анализ траекторий МД проводили с использованием библиотеки Python MDAnalysis для RGYR и RMSD siRNA. Модуль визуальной молекулярной динамики ( 38 ) MEMBPLUGIN ( 39 ) использовался для анализа траекторий мембран.

Исследования проникновения через кожу

Исследования проникновения через кожу проводились с использованием свиной кожи в FDC, как описано ранее ( 40 ). Общий объем 20 мкл Cy5-меченной РНК (50 мкМ) в растворах IL наносили на поверхность кожи свиньи и инкубировали при 40 ° C в течение 24 часов в закрытых условиях при умеренном перемешивании. Проницаемость кожи для РНК визуализировали и количественно оценивали с помощью конфокальной микроскопии и методов удаления ленты, соответственно (дополнительные материалы и методы).

Исследования на животных

Все исследования на животных проводились в Гарвардской школе инженерных и прикладных наук им. Джона А. Полсона Гарвардского университета. Проведенные процедуры и исследования были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных факультета искусств и наук Гарвардского университета и соответствовали всем применимым нормам. IL, несущие GAPDH (нестандартная миРНК, смысловая последовательность: 5′-GUGUGAACCACGAGAAAUAUU-3 ′ ’, антисмысловая последовательность: 5′-AAUAUUUCUCGUGGUUCACAC-3 ′; Dharmacon), siCon (номер в каталоге.D-001810-02-50; Dharmacon) и миРНК NFKBIZ (номер по каталогу J-040680-06-0050; Dharmacon) применяли местно к здоровым и безволосым мышам SKH-1E, получавшим имиквимод (Charles River), соответственно. Для измерения степени тяжести, эритемы и шелушения на спине мышей использовалась слепая система оценки, аналогичная шкале индекса области и тяжести псориаза человека (PASI). Кроме того, толщину кожи контролировали с помощью DSFT дорсальной кожи мышей с помощью штангенциркуля на протяжении всего периода индукции заболевания и лечения (дополнительные материалы и методы).

Количественное определение транскриптов мРНК

Мгновенно замороженные ткани кожи измельчали ​​в порошок и гомогенизировали в реагенте для лизиса QIAzol для подготовки лизатов тканей для количественной ПЦР. Уровни мРНК были количественно определены и нормализованы в соответствии с протоколом производителя. Относительное количество транскриптов мРНК и молчание в обработанных группах было нормализовано по гену домработницы (β-актин). Средние нормализованные значения обработки миРНК затем наносили на график с помощью их SEM (дополнительные материалы и методы).

Статистический анализ

Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) и статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.). Результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Двусторонний тест Стьюдента t использовался для сравнения между двумя группами. Параметрические данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующими апостериорными тестами по методу достоверно значимых различий Тьюки (HSD). Для непараметрических данных были выполнены тесты Краскела-Уоллиса. Статистические тесты указаны на рисунках. P <0,05 считали статистически значимым.

• Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки.Нет претензий к оригинальным работам правительства США. Распространяется по некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC).

Влияние перекиси водорода на заживление ран у мышей в связи с окислительным повреждением

Abstract

Установлено, что низкие концентрации перекиси водорода (H ₂ O ₂ ) образуются в ранах и необходимы для оптимального заживления. Но в то же время есть свидетельства того, что чрезмерное окислительное повреждение коррелирует с плохо заживающими ранами.В этой статье мы стремимся определить, может ли местное применение H ₂ O ₂ модулировать заживление ран и связаны ли его эффекты с окислительным повреждением. На модели эксцизионной раны мышей C57BL / 6 было обнаружено, что H ₂ O ₂ усиливает ангиогенез и закрытие раны при 10 мМ, но замедляет закрытие раны при 166 мМ. Задержка закрытия также была связана с уменьшением образования соединительной ткани, увеличением MMP-8 и стойкой инфильтрацией нейтрофилов. Было обнаружено, что ранение увеличивает окислительное повреждение липидов, измеренное с помощью изопростанов F ₂ , и повреждение нитрационного белка, измеренное с помощью 3-нитротирозина.Однако обработка H ₂ O ₂ не приводила к значительному увеличению окислительного и нитративного повреждения даже при концентрациях, замедляющих заживление ран. Следовательно, пагубные эффекты H ₂ O ₂ могут не включать окислительное повреждение изученных молекул-мишеней.

Образец цитирования: Loo AEK, Wong YT, Ho R, Wasser M, Du T, Ng WT, et al. (2012) Влияние перекиси водорода на заживление ран у мышей в связи с окислительным повреждением. PLoS ONE 7 (11): e49215.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215

Редактор: Хуан Састре, Университет Валенсии, Испания

Поступила: 17.08.2012; Принята к печати: 4 октября 2012 г .; Опубликовано: 13 ноября 2012 г.

Авторские права: © 2012 Loo et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа финансировалась Сингапурским национальным советом по медицинским исследованиям (NMRC 1205/2009, http://www.nmrc.gov.sg/) и Tan Chin Tuan Centennial Professorship (http: // www. tanfoundation.com.sg). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Различные группы показали, что H ₂ O ₂ играет важную роль в заживлении ран.Было показано, что нефагоциты после ранения продуцируют H ₂ O ₂ , который может привлекать нейтрофилы [1], а также способствовать реиннервации периферических сенсорных аксонов [2] в модели заживления ран у рыбок данио. H ₂ O ₂ и O ₂ ^.- также были обнаружены в ранах мышей [3], [4]. Сообщалось, что удаление H ₂ O ₂ из-за сверхэкспрессии каталазы у мышей задерживает закрытие раны и замедляет ангиогенез [3].

Неудивительно, но были предположения, что применение низких уровней H ₂ O ₂ может быть полезным для заживления ран [5]. Было обнаружено, что повязки с коллагеновой пленкой, содержащие глюкозооксидазу, способствуют заживлению ран на модели диабета у крыс, очевидно, за счет увеличения уровней активных форм кислорода (АФК) в ранах [6]. Глюкозооксидаза — это фермент, который окисляет глюкозу до глюконовой кислоты с образованием H ₂ O ₂ в качестве побочного продукта.Мед медицинского качества, который, как утверждается, способствует заживлению хронических ран [7], также содержит H ₂ O ₂ , возможно, опять же под действием глюкозооксидазы [8].

С другой стороны, считается, что чрезмерное количество АФК участвует в патогенезе хронических ран [9]. АФК могут вызывать повреждение, реагируя с нуклеиновыми кислотами, белками и липидами, вызывая потерю функции и повреждение тканей. Поскольку АФК, включая H ₂ O ₂ , по своей природе являются повреждающими, возможно, низкие концентрации H ₂ O ₂ будут способствовать заживлению, действуя как сигнальная молекула, в то время как высокие концентрации будут замедлять заживление, вызывая окислительное повреждение.Хотя эта гипотеза кажется привлекательной и простой, она никогда не подвергалась тщательной проверке. Фактически, влияние окислительного повреждения на заживление ран полностью не изучено.

Хотя известно, что АФК образуются после ранения, мало что известно об изменениях окислительного повреждения во время заживления ран. Клинические исследования показали, что жидкости из хронической раны содержат более высокие уровни изопростанов F ₂ , установленного маркера перекисного окисления липидов, чем жидкости из острой раны [10].Окисление белков, измеряемое карбонилами белка, также измерялось в жидкостях раны, но не было никакой разницы в абсолютном содержании карбонилов белка в экссудате острых и хронических ран. Однако было обнаружено, что жидкости хронической раны имеют более низкое содержание белка, таким образом, нормализованное содержание карбонила белка в хронической ране оказалось на 15% выше [11]. Это подчеркивает серьезные методологические проблемы, связанные с измерением окислительного повреждения раневых жидкостей, поскольку их состав может значительно варьироваться в зависимости от состояния гидратации пациента.Эти исследования раневых жидкостей также не дают ответа на фундаментальный вопрос о том, вызывает ли рана окислительное повреждение.

При использовании веществ, вступающих в реакцию с тиобарбитуровой кислотой (TBARS) в качестве биомаркера перекисного окисления липидов, ранние исследования фактически обнаружили снижение перекисного окисления липидов в ранах по сравнению с неповрежденной кожей [12], [13]. Однако следует отметить, что измерение TBARS является плохим маркером перекисного окисления липидов и чувствительно к артефактам [14]. Другие авторы показали увеличение окислительного повреждения между ранами на моделях мышей дикого типа и с дефицитом пероксиредоксина-VI, но об уровнях окислительного повреждения в неповрежденной коже не сообщалось [9], [15].

В настоящем исследовании мы преследуем две основные цели. Во-первых, мы стремились измерить изменения окислительного повреждения с течением времени на модели полной иссеченной раны. Во-вторых, мы модулировали уровень ROS путем местного нанесения H ₂ O ₂ , чтобы определить, может ли чрезмерное окислительное повреждение способствовать плохому заживлению ран. Три биомаркера окислительного повреждения, а именно изопростаны F ₂ , белковые карбонилы и 3-нитротирозин, были использованы для определения изменений уровня окислительного повреждения.

Материалы и методы

Материалы

Буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA) был приобретен в Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Крысиный анти-MMP-8 (№ по каталогу: 2145-1) был приобретен в компании Epitomics (Burlingame, CA, USA). Кроличьи анти-CD31 (№ по каталогу: ab28364) и кроличьи анти-ММР-9 (№ по каталогу: ab38898) были приобретены у Abcam (Кембридж, Великобритания). Моноклональные антитела крысы против F4 / 80 и 7/4 мыши были приобретены у Serotec (Роли, Северная Каролина, США). Крысиные антитела против TIMP-1 (№ по каталогу: MAB980) были приобретены в R&D systems (Миннеаполис, Миннесота, США).Среда для крепления против выцветания Prolong-gold с DAPI была приобретена у Life Technologies. Смесь ингибиторов фосфатазы, PhosSTOP, и смесь ингибиторов протеазы, Complete mini-EDTA, были приобретены у Roche (Базель, Швейцария). Набор векторов пероксидазы авидин биотиновый комплекс (ABC) был приобретен в Vector Labs (Burlingame, CA, USA). В качестве гематоксилина использовали гематоксилин Shandon Instant Haematoxylin, закупленный у Thermofisher (Waltham, MA, USA). Козье вторичное антитело против кролика, конъюгированное с пероксидазой хрена (Cat 0031460), конъюгированное с пероксидазой хрена вторичное антитело козы против мыши (Cat 0031430), субстрат усиленной хемилюминесценции и N, O-бис (триметилсилил) трифторацетамид + 1% триметилхлорсилан MCS (BSTFA + TSTFA + T были получены от Pierce Chemicals (Рокфорд, Иллинойс, США).Набор для определения окисления белков оксиблотом, набор для ELISA с 3-нитротирозином и набор для твердофазного анализа ELISA для обнаружения CXCL1, CXCL5, CCL2 и CCL3 мышей были приобретены в компании Millipore (Billerica, MA, USA). Все остальные химические вещества были приобретены у Sigma-aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).

Обработка животных и иссечение ран Модель

Восьминедельных мышей C57 / BL6 были получены из центра по уходу за лабораторными животными NUS. Метод создания иссеченной раны и последующего мониторинга был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных NUS (NUS 095/09).Животных кормили стандартной диетой и содержали в помещении, свободном от конкретных патогенов. Перед ранением мышей акклиматизировали в течение недели. Процедура проводилась под наркозом, индуцированным изофлураном. Были созданы четыре полные иссеченные раны с помощью 5-миллиметрового кожного штампа. Затем размер ран сразу же отслеживали на кусочке стерильного прозрачного пластикового листа. Затем в рану осторожно добавляли 15 мкл PBS или H ₂ O ₂ , разведенных в PBS (рис. 1A).Мышей выдерживали под анестезией еще 5 мин, чтобы позволить H ₂ O ₂ впитаться в рану. Затем на шею надевали ошейник елизаветинской мыши, чтобы мыши не кусали или не зализывали раны. Мышей также содержали отдельно, чтобы они не кусали и не зализывали друг другу раны. 0,1 мг / кг бупренорфина вводили подкожно сразу после ранения, а также каждые 24 часа в течение 4 дней после ранения для облегчения боли.

Рисунок 1.Низкие концентрации H ₂ O ₂ способствовали закрытию раны, но высокие концентрации его замедляли закрытие раны.

(A) На каждой мыши были созданы четыре полные иссеченные раны, и 15 мкл H ₂ O ₂ было добавлено в полость раны, как показано. Левая панель представляет собой репрезентативное изображение полученных ран. На правой панели показано, как H ₂ O ₂ наносится на раны. (B) Влияние различных концентраций H ₂ O ₂ на скорость заживления ран.Размер ран у 6-8 мышей контролировали в течение 6 и 10 дней соответственно, прежде чем они были подвергнуты эвтаназии. Показанный график представляет собой среднее значение ± S.E.M. объединенных результатов. Для анализа размера раны использовали однофакторный дисперсионный анализ. Различия между 166 мМ H ₂ O ₂ и контролем (p <0,05) или 10 мМ H ₂ O ₂ (p <0,01) были статистически значимыми на 6-й день. Различия между 10 мМ H ₂ O ₂ и контроль (p <0,05) были статистически значимыми на 8 и 10 день.Различия между 10 мМ и 166 мМ H ₂ O ₂ также были статистически значимыми на 8-й день (p <0,05), но не на 10-й день.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.g001

Для мониторинга размера раны мышей анестезировали и измеряли размер ран, проводя их по куску стерильного прозрачного пластикового листа, как описано в предыдущем разделе. Затем на рану повторно наносили PBS или H ₂ O ₂ . Для сбора тканей мышей умерщвляли удушением CO ₂ и удаляли раневые ткани с помощью 10-миллиметрового кожного перфоратора.Ткани обрабатывали в зависимости от анализов, которые должны были быть выполнены.

Подготовка гистологических срезов

Образцы свежевырезанных ран были разделены пополам и обработаны либо для парафина, либо для криосрезов. Образцы для парафиновых срезов фиксировали сразу после сбора в 10% забуференном фосфатом формалине (pH 7,4). Образцы обычно обезвоживали, очищали и помещали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм готовили на липких предметных стеклах.Свеже собранные образцы ран для криосрезов заливали компаундом с оптимальной температурой резания (OCT) и замораживали с использованием суспензии сухого льда и изопентана. Криосрезы толщиной 6–8 мкм готовили на липких предметных стеклах.

Трихромное пятно по Массону

Парафиновых срезов депарафинизировали, регидратировали и окрашивали с использованием набора для окрашивания трихромом Массона-Голднера в соответствии с инструкциями производителя. Микрофотографии были сделаны с объективом с 20-кратным увеличением и освещением в светлом поле с использованием микроскопа Olympus BX 51.Изображение всей области раны было получено путем объединения нескольких полей вместе с помощью Adobe Photoshop CS5. Количество зеленых пикселей в neodermis определяли количественно и выражали как долю от размера области раны. Неодерма относится к новообразованной грануляционной ткани под гиперпролиферирующим эпидермисом и / или струпом, лишенной волосяных фолликулов.

Чтобы количественно определить количество зеленых пикселей, мы разработали специальное программное обеспечение для сегментации цветного изображения, которое было реализовано в виде подключаемого модуля ImageJ.Программное обеспечение можно бесплатно загрузить по адресу http://web.bii.a-star.edu.sg/archive/colseg/. Описание программного обеспечения и руководство пользователя приведены в дополнительной информации (Руководство S1).

Иммуногистохимический краситель CD31

CD31 окрашивали иммуногистохимическим методом. Парафиновые срезы депарафинизировали и регидратировали. Срезы кипятили в 10 мМ натрийцитратном буфере с pH 6,0 в течение 15 мин. Затем образцы обрабатывали с помощью набора для амплификации пероксидазы ABC с некоторыми изменениями по протоколу производителя.Срезы блокировали 1,5% козьей сывороткой в ​​трис-буферном физиологическом растворе (TBS) в течение ночи при 4 ° C. После блокирования срезы инкубировали с кроличьими поликлональными анти-CD31, разведенными в 1,5% козьей сыворотке при разведении 1–50 в течение 1 ч. Затем предметные стекла промывали TBS перед инкубацией с биотинилированным вторичным антителом против кролика при разведении 1-200 в течение 1 часа. Затем предметные стекла промывали и инкубировали с реагентом авидин-биотиновой кассеты в течение 30 мин. Активность пероксидазы окрашивали с использованием диаминобензидина с использованием DAB + в соответствии с протоколом производителя в течение 30 минут с последующей промывкой в ​​TBS и контрастным окрашиванием гематоксилином.Слайды были обезвожены, очищены и закреплены с помощью монтажной среды DPX.

Микрофотографии срезов были сделаны с объективом с 20-кратным увеличением и освещением в ярком поле с использованием микроскопа Olympus BX 51. Изображение всей области раны было получено путем объединения нескольких полей вместе с помощью Adobe Photoshop CS5. Количество кровеносных сосудов в неодерме подсчитывали и нормализовали по площади поперечного сечения каждой секции. Подсчет проводился слепым методом двумя членами лаборатории, и результаты являются средними для обоих подсчетов.Средняя разница между подсчетами каждого пользователя от среднего составляет 14,8%.

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Замороженные срезы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 20 мин. Срезы блокировали усилителем сигнала Image-iT FX на 2 часа. Затем их инкубировали с первичными антителами, антимышиным F4 / 80 или анти-7/4, в течение 2 часов при комнатной температуре и 1-1000 в TBS. В качестве вторичного антитела использовали козье антитело против крысы Alexa Fluor 594 при разведении 1-1000 в TBS в течение 30 минут при комнатной температуре.Слайды были закреплены на среде, препятствующей выцветанию, содержащей DAPI, и оставлены на ночь для отверждения на плоской поверхности в темноте. Слайды визуализировали и фотографировали с помощью микроскопа Olympus BX 51 с постоянной выдержкой. Изображение всей неодермы было получено путем объединения нескольких полей вместе с помощью Adobe Photoshop CS5. Анализ изображения проводился с помощью ImageJ (NIH). Сначала изображения были разделены на каналы RGB. Коррекция фона выполнялась с использованием катящегося шарика радиусом 50 пикселей.Затем измеряли интенсивность флуоресценции неодермы. Отрицательные контроли без инкубации первичных антител не показали флуоресцентного окрашивания.

Экстракция белка

Ткани раны для анализа белков замораживали в сухом льду сразу после сбора и хранили при -80 ° C до анализа. Для экстракции белка две ткани раны (приблизительно 100 мг) животного разрезали на мелкие кусочки и добавляли 500 мкл ледяного буфера RIPA с смесью ингибиторов протеазы и фосфатазы.Образцы обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового датчика высокой интенсивности (Sonics Vibra-Cell, Newtown, CT, USA), а затем центрифугировали в течение 10 минут при 10 000 g, 4 ° C. Супернатант собирали и использовали для вестерн-блоттинга, ELISA с 3-нитротирозином, анализа мультиплексных цитокинов и анализа карбонила белка.

Вестерн-блоттинг

Тридцать микрограммов белка подвергали электрофорезу на 10% SDS-полиакриламидном геле для анализа ERK1 / 2, p38 MAPK, MMP-8, MMP-9 и TIMP-1. Гели переносили влажным переносом на нитроцеллюлозные мембраны.Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в TBST в течение 1 ч при комнатной температуре перед инкубацией с антителами в течение ночи при 4 ° C. Разведения всех антител составляли 1-1000, за исключением p-ERK1 / 2, который был разведен 1-2000. Блоты визуализировали методом хемилюминесценции с использованием системы визуализации Chemidoc XRS (Bio-Rad, Милан, Италия). Денситометрию проводили с помощью ImageJ.

3-нитротирозин ELISA

Анализ проводился согласно инструкции производителя. На лунку загружали 300 мкг белка.Стандартная кривая была построена в GraphPad Prism путем подгонки к пятипараметрическому логистическому уравнению. Уровни 3-нитротирозина в образцах определяли с помощью функции интерполяции в программном обеспечении.

Мультиплексный анализ цитокинов

Анализ проводился в соответствии с инструкциями производителя. На лунку загружали 75 мкг белка. Анализ выполнялся на системе Millipore Milliplex, а результаты анализировались с использованием аналитического программного обеспечения Milliplex.

F

Ткани раны для анализа F ₂ -изопростана замораживали на сухом льду сразу после сбора и хранили при -80 ° C до анализа.Изопростаны F ₂ анализировали с использованием ранее опубликованных методов с небольшими модификациями [16], [17]. Липиды экстрагировали из 2 цельных ран (приблизительно 100 мг). Раны гомогенизировали в 0,5 мл PBS (pH 7,4) и 1 мл смеси органических растворителей Folch (CHCl ₃ : метанол, 2-1 об. / Об., + 0,005% BHT) при 4 ° C. После центрифугирования при 2300 g в течение 10 мин нижний органический слой осторожно переносили в стеклянный сосуд и сушили под потоком N ₂ .Высушенный липидный экстракт ресуспендировали в 0,25 мл деионизированной воды и добавляли 0,25 мл 1 М КОН (в чистом метаноле) для гидролиза липидов. Тяжелый изотоп F _{2 внутренние стандарты} -изопростана и арахидоновой кислоты (0,5 нг IPF _2a — VI-d ₄ , 0,25 нг 8-изо-PGF _2a -d ₄ , 0,5 нг IPF _2a -IV-d ₄ и 1,0 мкг арахидоновой кислоты-d ₈ в 20 мкл этанола).

N ₂ газ вводили в каждую пробирку с образцом, которую затем закрывали для предотвращения дальнейшего окисления.Гидролиз проводили в течение ночи при комнатной температуре в темноте. После гидролиза добавляли 1 мл деионизированной воды и 1 мл 40 мМ уксусной кислоты. PH образцов доводили до 4,5 с помощью 6 M HCl.

Колонки MAX (смешанный ионный обмен, Waters), 60 мг, предварительно кондиционировали 2 мл метанола, а затем 2 мл 40 мМ муравьиной кислоты (pH 4,5). Затем в колонку загружали липидный экстракт и колонку промывали 2 мл метанола: 20 мМ муравьиной кислоты, pH 4,0 (3–7). В колонку вводили 2 мл гексана, а затем еще 2 мл смеси ацетон: гексан (3∶7).Наконец, арахидоновую кислоту и изопростаны F ₂ элюировали из колонки для SPE 1,8 мл смеси ацетон: метанол (4-1), собирали и сушили в атмосфере газа N ₂ .

Образцы дериватизировали 12,5 мкл DIPEA (10% об. Ацетонитрила) и 25 мкл PFBBr (10% об. Ацетонитрила) при комнатной температуре в течение 30 мин и сушили в атмосфере азота. К высушенным образцам добавляли 12,5 мкл ацетонитрила и 25 мкл BSTFA + TMCS, реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч силилирования, а затем сушили.Дериватизированные образцы восстанавливали в 30 мкл изооктана и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 минут перед анализом ГХ-МС.

Дериватизированные образцы анализировали с помощью масс-селективного (МС) детектора Hewlett-Packard 5973N (Agilent Technologies), сопряженного с газовым хроматографом (ГХ) Hewlett-Packard 6890 (Agilent Technologies), оснащенного автоматическим пробоотборником и компьютерной рабочей станцией. Порт инжекции и интерфейс ГХ-МС поддерживали при 270 и 300 ° C соответственно. Масс-спектрометр использовался в режиме отрицательной химической ионизации (NCI) с источником ионов и квадруполем при 150 и 106 ° C, соответственно, и скорость потока метана была установлена ​​на 2 мл / мин.Хроматографическое разделение проводили на капиллярной колонке из плавленого кварца (30 м × 0,2 мм внутренний диаметр), покрытой сшитым 5% фенилметилсилоксаном (толщина пленки 0,33 мкм) (Agilent Technologies). Газ-носитель, гелий, был установлен на расход 1 мл / мин. Дериватизированные образцы (1 мкл) вводили без разделения в порт ввода ГХ. Температура колонки поддерживалась на уровне 180 ° C в течение 0,75 мин, затем повышалась до 275 ° C со скоростью 40 ° C / мин, а затем поддерживалась при 275 ° C в течение 9 минут. Наконец, температуру повышали до 300 ° C со скоростью 40 ° C / мин и выдерживали в течение 10 минут.Мониторинг выбранных ионов выполняли для мониторинга карбоксилат-иона (M-181: потеря пентафторбензила, CH ₂ C ₆ F ₅ ) на ионах m / z 569 для 8-изо-PGF _2α и при m / z 573 для меченных дейтерием внутренних стандартов (8-iso-PGF _2α -d ₄ и IPF _2α -VI-d ₄ ). Количественное определение было достигнуто путем соотнесения площади пика всех F ₂ -IsoP с суммой пиков внутреннего стандарта двух различных F ₂ -IsoP (8-iso-PGF _2α -d ₄ и IPF _2α -VI-d ₄ ).Сообщенные значения представляют собой сумму 8-изо-PGF _2α , IPF _2α -VI и IPF _2α -IV.

Арахидонат также был проанализирован с помощью GC-MS-NCI с использованием того же прибора и условий колонки, как описано выше, за исключением следующего: гелий был установлен на скорость потока 1 мл / мин и дериватизированные образцы (1 мкл) вводились без разделения в порт ввода ГХ. Температуру колонки поддерживали на уровне 180 ° C в течение 0,75 мин, затем повышали до 310 ° C со скоростью 40 ° C / мин и затем выдерживали в течение 8 минут.Ионы-мишени и квалификаторы были выбраны для выбранного режима ионного мониторинга ГХ-МС для мониторинга карбоксилат-иона (M-181: потеря пентафторбензила, CH ₂ C ₆ F ₅ ) при ионах m / z 303 для арахидонат и m / z 311 для внутреннего стандарта арахидоновой кислоты d8, меченной дейтерием. Количественное определение было достигнуто путем соотнесения площади пика общего арахидоната с пиком внутреннего стандарта. Время удерживания для 8-изо-PGF _2α , IPF _2α -VI, IPF _2α -IV и арахидоновой кислоты составляло 11.3, 11,3, 11,50 и 5,2 мин соответственно.

Определение карбонила белка

Карбонилы белков определяли с помощью набора для окисления белков OxyBlot. После гомогенизации ткани 25 мкл лизата ткани смешивали с 10 мкл 12% SDS и 20 мкл 20 мМ 2,4-динитрофенилгидразина (DNPH). После 15 мин инкубации при комнатной температуре добавляли 15 мкл нейтрализующего раствора (2 М Трис, 30% глицерин). Объем, эквивалентный 3,8 мкг белка, затем загружали в устройство для слот-блоттинга (Bio-Rad, Hercules, США) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану под вакуумом.Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в TBST в течение 1 часа перед зондированием антителами против DNPH (1-150) и конъюгированными с HRP антителами против IgG кролика (1-300) в течение 1 часа каждое. Блоты визуализировали по хемилюминесценции с использованием системы визуализации Chemidoc XRS.

Результаты

10 мМ H

Было обнаружено, что местное нанесение H ₂ O ₂ в концентрации 166 мМ замедляет заживление ран (рис. 1B) по сравнению с контрольными мышами.Эта концентрация доставляет 2,5 мкмоль H ₂ O ₂ на рану. Фармакологически эта концентрация также эквивалентна 0,5% раствору H ₂ O ₂ , который аналогичен концентрациям, обычно используемым для дезинфекции (от 0,5 до 3%). Несмотря на то, что H ₂ O ₂ при 166 мМ первоначально задерживало закрытие раны, скорость закрытия раны увеличивалась во время последней части процесса заживления, и не было различий в размере ран на 8-й и 10-й день по сравнению с контрольными мышами. .H ₂ O ₂ при 10 мМ немного увеличивал скорость закрытия раны (рис. 1B) по сравнению с контрольными мышами.

Похоже, что местное нанесение H ₂ O ₂ в концентрации 166 мМ задерживает начальный процесс заживления у мышей. Поэтому мы решили подробно изучить процесс заживления на 6-й день после ранения, то есть в середине процесса заживления. Образование соединительной ткани измеряли с помощью окрашивания трихромом Массона [18]. Окрашивание трихромом Массона по-разному окрашивает соединительные ткани, в основном коллаген, поскольку они менее пористые по сравнению с другими тканевыми компонентами.Ангиогенез оценивали с использованием иммуногистохимического окрашивания CD31, маркера клеточной поверхности эндотелиальных клеток.

Раны, обработанные 166 мМ H ₂ O ₂ , показали снижение образования соединительной ткани, о чем свидетельствует уменьшение количества участков, окрашенных в зеленый цвет, по сравнению с контролем. 10 мМ H ₂ O ₂ не влияли на образование соединительной ткани (рис. 2). 166 мМ H ₂ O ₂ не влияли на ангиогенез, но 10 мМ H ₂ O ₂ сильно стимулировали его (фиг. 3).Эти результаты иммуноокрашивания соединительной ткани и CD31 соответствовали нашим наблюдениям, что 166 мМ H ₂ O ₂ задерживали закрытие раны, но 10 мМ H ₂ O ₂ способствовали этому.

Рис. 2. Высокие концентрации H ₂ O ₂ замедляют образование соединительной ткани.

Парафиновые срезы ран на 6 день окрашивали трихромом Массона-Голднера, как описано в материалах и методе. Соединительные ткани окрашиваются в зеленый цвет.Фибрин, струп и цитоплазма окрашиваются в красный цвет. Ядра окрашены в темно-коричневый цвет. Показаны репрезентативные изображения для контрольных (A, D) ран, обработанных 10 мМ (B, E) и 166 мМ (C, F). Изображения A-C имеют 100-кратное увеличение, а D-F — 200-кратное увеличение. (G) Количественная оценка доли пикселей, окрашенных в зеленый цвет. Количество окрашенных в зеленый цвет пикселей в неодерме при 100-кратном увеличении определяли количественно с использованием специального программного обеспечения. Количественно определенная площадь обведена пунктирной линией. Результаты были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим тестом множественного сравнения Даннета с контролем.Показанный график представляет собой среднее значение ± S.E.M. n = 6–7, *** p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.g002

Рис. 3. Низкие концентрации H ₂ O ₂ увеличивают ангиогенез раны.

Парафиновые срезы ран на 6-й день окрашивали на CD31 с использованием иммуногистохимического метода. Показаны репрезентативные микрофотографии (A) контроля, (B) 166 мМ H ₂ O ₂ и (C) 10 мМ H ₂ O ₂ обработанных ран.(D) Количество коричневых просветоподобных структур в неодермисе подсчитывали одним слепым методом и анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим множественным сравнительным тестом Даннета с контролем. Показанный график представляет собой среднее значение ± S.E.M, n = 6–7, *** p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.g003

H

Повышенное содержание MMP-8 и 9 наблюдалось при хронических ранах [26].Таким образом, мы предположили, что H ₂ O ₂ может повышать уровни MMP-8 и 9 в ранах и, возможно, приводить к уменьшению отложения соединительной ткани. Уровни MMP-8 и 9 в ранах измеряли с помощью вестерн-блоттинга (фиг. 4).

Рисунок 4. Высокие концентрации H ₂ O ₂ увеличивают уровни MMP-8 в ранах.

Вестерн-блоттинг лизата тканей раны, собранного через 6 дней после ранения. Каждая дорожка представляет собой образец от другого животного.(A) Репрезентативный блот MMP-8. (B) Денситометрический анализ MMP-8, нормализованный относительно α-тубулина, повторно зондированный с их соответствующего блота. Результаты являются средними ± S.E.M. (n = 4), и были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим множественным сравнением Тьюки среди всех столбцов. ** p <0,01 (C) Репрезентативный блот MMP-9. (D) Денситометрический анализ MMP-9, нормализованный относительно α-тубулина, повторно зондированный из их соответствующего блота. Результаты являются средними ± S.E.M. (n = 4), значения p для одностороннего дисперсионного анализа p = 0,13.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0049215.g004

Вестерн-блоты ММП-8 имели сильно иммунореактивную полосу около 57 кДа, что соответствует активированной форме ММП-8, полученной из полиморфно-ядерных клеток. Слабая иммунореактивность наблюдалась также при 21 кДа, о котором ранее сообщалось, что это деградированный фрагмент MMP-8 [19]. Слабая иммунореактивность наблюдалась также в полосах 45 и 55 кДа, которые могли быть MMP-8, полученным из неполиморфно-ядерных клеток [20].

Анализ результатов денситометрии полосы 57 кДа показан на рисунке 4В.Было обнаружено, что местное нанесение 166 мМ H ₂ O ₂ увеличивало уровни белка активированной ММР-8 в ранах, но 10 мМ не влияли на уровни белка ММП-8 (p <0,01). Денситометрический анализ был также проведен для фрагмента 21 кДа, и было обнаружено, что он следует той же тенденции, что и иммунореактивная полоса при 57 кДа, что указывает на то, что степень деградации пропорциональна количеству MMP-8 (данные не показаны).

Мышиный pro-MMP-9 отображается как полоса размером 105 кДа на SDS-PAGE, в то время как активированная MMP-9 имеет размер 97 кДа [21].Мы наблюдали полосы с сильной иммунореактивностью с молекулярной массой, которые соответствуют зимогену, но не расщепленным активным формам. Было обнаружено, что H ₂ O ₂ увеличивает уровни про-ММР-9, но это повышение не было статистически значимым. p -значение для одностороннего дисперсионного анализа было 0,1329.

Было также измерено влияние H ₂ O ₂ на уровни тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (ТИМП-1) (фигура S1). Две полосы наблюдались при приблизительно 28 кДа, что могло быть связано с различными гликозилированными изоформами [22].По результатам денситометрического анализа было обнаружено, что H ₂ O ₂ не вызывает каких-либо изменений в уровнях TIMP-1, независимо от используемой концентрации.

Высокие концентрации H

Эффект H ₂ O ₂ на инфильтрацию нейтрофилов и макрофагов также оценивали с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания (рис. 5). У контрольных мышей мы наблюдали сильное иммунофлуоресцентное окрашивание нейтрофилов на 1-й день после ранения, которое уменьшалось по мере заживления раны, что было похоже на тенденции, описанные в литературе [23].Однако раны, обработанные 166 мМ H ₂ O ₂ , показали более сильное иммунофлуоресцентное окрашивание на 1 и 6 день по сравнению с контрольными ранами. Это указывает на то, что H ₂ O ₂ вызывал большую инфильтрацию нейтрофилов, которая также сохранялась в течение более длительного периода времени. С другой стороны, не было изменений в инфильтрации нейтрофилов в ранах, обработанных 10 мМ H ₂ O ₂ (Рисунок S2). Обе концентрации H ₂ O ₂ не влияли на инфильтрацию макрофагов (Рисунок S3).

Рисунок 5. 166 мМ H ₂ O ₂ увеличенная нейтрофильная инфильтрация в 1-й и 6-й день ран.

Интенсивность флуоресценции неодермы определяли количественно с помощью ImageJ. Количественно определенная площадь обведена пунктирной линией. Показанные результаты представляют собой среднее значение ± S.E.M, n = 6-7. Показан репрезентативный раздел каждого лечения. ES — Эшар; HE — гиперпролиферирующий эпидермис; НД — неодерма. * P <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.g005

Высокие концентрации H

Ранее мы обнаружили, что H ₂ O ₂ может улучшать заживление ран, активируя путь MAPK на модели царапин кератиноцитов [24]. Поэтому мы приступили к исследованию, оказывает ли H ₂ O ₂ также эффект на путь MAPK в этой модели заживления ран in vivo . Вестерн-блот-анализ, сравнивающий неповрежденную кожу с тканями края раны, показал, что ранение активирует передачу сигналов ERK1 / 2 и p38, и через 30 мин после ранения наблюдалось увеличение фосфорилирования.(Рисунок 6). Также было замечено, что обработка 166 мМ H ₂ O ₂ дополнительно увеличивает уровень фосфорилирования. Однако сигнал фосфорилирования ослабевал через 4 часа после ранения, и никакой разницы в фосфорилировании не наблюдалось между кожей, контрольными ранами и обработанными ранами H ₂ O ₂ (фигура S4). Это контрастирует с постоянным (не менее 8 часов) сигналом ERK1 / 2 и p38, который мы наблюдали в кератиноцитах, обработанных H ₂ O ₂ в культуре клеток [24].

Рис. 6. Ранение увеличивает фосфорилирование ERK1 / 2 и p38, которое может быть дополнительно увеличено обработкой 166 мМ H ₂ O ₂ .

(A) Репрезентативные блоты лизата тканей раны, собранные через 30 мин после ранения. Кожа означает кожу нераненых животных, тогда как контроль означает раны, обработанные PBS. (B) Плотность фосфорилированных ERK и pan-ERK и (C) фосфорилированных p38 и pan p38 нормализовали против α-тубулина, повторно зондированного из их соответствующего блота.Показанные результаты представляют собой среднее значение ± S.E.M. (n = 4). Результаты денситометрии были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, и критерий значимости для всех столбцов был определен с использованием апостериорного критерия Тьюки. Только сравнение обработанных 166 мМ ран и кожи было статистически значимым как для B, так и для C. ** p <0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.g006

166 мМ H

Из наших результатов следует, что 166 мМ H ₂ O ₂ замедляют заживление ран, создавая более протеолитическую среду.Однако имеется мало информации о том, может ли H ₂ O ₂ в высоких концентрациях, таких как 166 мМ, вызывать окислительное повреждение ран. Уровни изопростанов F ₂ в ранах использовали в качестве надежного индикатора перекисного окисления липидов [25]. Уровни изопростанов F ₂ обычно нормализованы относительно арахидоновой кислоты, жирной кислоты-предшественника изопростанов. Однако такая нормализация может быть спорной [26], поэтому мы решили показать уровни F ₂ -isoprostanes и без нормализации против арахидоновой кислоты.Общие уровни изопростанов типа III, IV и VI были суммированы и выражены в расчете на единицу арахидоновой кислоты (фиг. 7A) и на единицу веса ткани (фиг. 7B).

Рис. 7. Ранение увеличивает перекисное окисление липидов и нитратное повреждение, но не карбонилирование белка.

Уровни F ₂ -изопростанов в коже и ранах сравнивали путем нормализации относительно арахидоновой кислоты (A) или веса ткани (B). Показанные результаты представляют собой среднее значение ± S.E.M, n = 5. Раны сравнивали с кожей, используя однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным тестом Даннета.Звездочки обозначают уровень значимости по сравнению с кожей. Контроль и H ₂ O ₂ ран также сравнивали друг с другом с использованием двухфакторного дисперсионного анализа, но различия не были статистически значимыми. (C) Уровни арахидоновой кислоты в коже и тканях ран. Показанные результаты представляют собой среднее значение ± S.E.M, n = 5. Раны сравнивали с кожей, используя однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным тестом Даннета. Звездочки обозначают уровень значимости по сравнению с кожей. Контроль и H ₂ O ₂ ран также сравнивали друг с другом с использованием двухфакторного дисперсионного анализа, но различия не были статистически значимыми.(D) Уровни карбонилов белка в ранах сравнивали с неповрежденной кожей и выражали как кратное изменение. Показанные результаты представляют собой среднее кратное изменение ± S.E.M. Не наблюдали разницы в уровнях карбонила протеина в контрольных ранах и ранах, обработанных 166 мМ H ₂ O ₂ . (E) Сравнение уровня 3-нитротирозина в коже и ранах. Показанные результаты представляют собой среднее значение ± S.E.M., n = 5. Уровни 3-нитротирозина в коже сравнивали с контрольными ранами или обработанными ранами H ₂ O ₂ и анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим апостериорным тестом Даннета.Уровни 3-нитротирозина были значительно выше на 6-й день после ранения. Уровни 3-нитротирозина в контроле и ранах, обработанных 166 мМ H ₂ O ₂ , также сравнивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа, и различия не были статистически значимыми. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.g007

Как показано на Фигуре 7A, при ранении значительно увеличиваются уровни F ₂ -изопростанов через 1 день после ранения как для контроля, так и для H ₂ O ₂ обработанных ран.Повышение содержания изопростанов F ₂ в день 6 H ₂ O ₂ и в день 10 контрольных ран также было статистически значимым по сравнению с неповрежденной кожей. Хотя увеличение F ₂ -изопростанов для других временных точек не было статистически значимым, следует отметить, что их 95% доверительные интервалы (не показаны) не перекрываются с доверительными интервалами для интактной кожи. Следовательно, повышение уровня изопростанов F ₂ на 3 и 6 день все еще может быть биологически важным.Уровни изопростанов F ₂ в контроле и ран, обработанных H ₂ O ₂ , также сравнивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа, но различия не были статистически значимыми. Это указывает на то, что нанесенный H ₂ O ₂ не вызывал дополнительного перекисного окисления липидов.

Мы также показали уровень изопростанов F ₂ , нормализованный по массе ткани, вместо арахидоновой кислоты. Результаты показали аналогичную тенденцию к уровням изопростанов F ₂ , нормализованных относительно арахидоновой кислоты, но с большей стандартной ошибкой для всех точек данных (фиг. 7B).Это означает, что нормализация по арахидоновой кислоте может быть важной для учета изменений в тканях. Интересно, что мы также обнаружили, что количество арахидоновой кислоты было выше в ранах по сравнению с неповрежденной кожей, причем разница была статистически значимой между неповрежденной кожей, контрольными ранами на 3-й день и 6-м днем ​​H ₂ O ₂ обработанные раны (Рисунок 7C ). Это повышает вероятность того, что увеличение количества F ₂ -изопростанов может быть затруднено увеличением его предшественника.Однако следует отметить, что увеличение содержания арахидоновой кислоты (увеличенное с 3 дня) отстает от увеличения F ₂ -изопростанов (увеличенное с 1 дня). Таким образом, мы считаем, что увеличение количества изопростанов F ₂ не может быть просто связано с повышением уровней исходного субстрата. Мы также сравнили уровни арахидоновой кислоты между контролем и ранами, обработанными H ₂ O ₂ , с использованием двухфакторного дисперсионного анализа и не обнаружили значительных различий.

АФК также может вызывать окисление белков, которое можно оценить, измерив уровни присутствующих карбонилов белка [27].Для измерения карбонилов белка использовали метод слот-блоттинга, и плотность полос от ран сравнивали с плотностью полос неповрежденной кожи и выражали как кратное изменение (фигура 7D). Было обнаружено, что уровни карбонилов белка, присутствующие в ранах, были сопоставимы с уровнем в неповрежденной коже. 166 мМ H ₂ O ₂ также не вызывали какого-либо дальнейшего повышения уровней карбонилов белка по сравнению с контрольными ранами.

Мы также оценили уровень активных форм азота в ранах, измерив уровни 3-нитротирозина, биомаркера повреждения нитратом [28].Было также обнаружено, что ранение увеличивает уровень 3-нитротирозина (рис. 7E). В отличие от изопростанов F ₂ , было обнаружено, что уровни 3-нитротирозина максимально увеличиваются на 6-й день вместо 1-го дня. H ₂ O ₂ также не увеличивал нитратное повреждение.

Обсуждение

Ранее сообщалось, что местное применение 50 мМ H ₂ O ₂ может способствовать закрытию раны в мышиной модели заживления ран одновременно с усилением ангиогенеза.Однако было обнаружено, что 3% H ₂ O ₂ (980 мМ) задерживают заживление [3]. 3% H ₂ O ₂ также было показано на модели заживления ран на свинье замедлить заживление вместе с уменьшением толщины дермы [29].

По нашим результатам, 10 мМ H ₂ O ₂ способствовали закрытию раны и ангиогенезу, тогда как 166 мМ H ₂ O ₂ (0,5%) вызывали уменьшение образования соединительной ткани и замедление закрытия ран. Однако в предыдущих исследованиях не изучалось влияние H ₂ O ₂ на уровень окислительного повреждения.В нашем исследовании мы обнаружили, что высокие концентрации H ₂ O ₂ замедляют заживление ран без увеличения окислительного и нитративного повреждения. Это означает, что H ₂ O ₂ может вызывать плохое заживление за счет других механизмов, помимо окисления этих биологических субстратов.

Мы обнаружили, что возможный механизм, с помощью которого H ₂ O ₂ может задерживать заживление, заключается в уменьшении образования соединительной ткани, возможно, за счет увеличения уровней ММП.Было высказано предположение, что чрезмерный протеолиз может быть причиной плохого заживления хронических ран [30], [31]. В нашем исследовании мы наблюдали статистически значимое увеличение уровней MMP-8 и меньшее, несущественное увеличение MMP-9 для ран, обработанных H ₂ O ₂ . ММП-8 является преобладающей коллагеназой в острых и хронических ранах [32], тогда как ММР-9 является наиболее распространенной желатиназой в хронических ранах [31]. MMP-8 расщепляет тройной спиральный коллаген на определенных участках, что приводит к автоденатурации коллагена до желатина, который в дальнейшем может расщепляться желатиназами, такими как MMP-9 [33], [34].Как и ожидалось, сверхэкспрессия MMP-8 или -9 ведет к плохому заживлению [35], [36]. Однако также было показано, что истощение MMP-8 или -9 задерживает заживление [37], [38]. Похоже, что MMP-8 и -9 должны присутствовать на оптимальном уровне в течение нужного периода времени для достижения эффективного заживления, и что местное нанесение H ₂ O ₂ может нарушить физиологический баланс.

ТИМП-1 образует комплекс 1-1 с металлопротеиназами, подавляя их активность [39].Было замечено, что хронические раны имеют тенденцию иметь более низкие уровни TIMP-1 и что это может быть причиной повышенного протеолиза в хронических ранах [31]. Однако мы не наблюдали различий в уровнях TIMP-1 между ранами, обработанными различными концентрациями H ₂ O ₂ в нашей модели.

Существует несколько возможных причин повышенной инфильтрации нейтрофилов, наблюдаемой в ранах, обработанных 166 мМ H ₂ O ₂ . H ₂ O ₂ может действовать как хемоаттрактант для нейтрофилов.Было показано, что ранение у рыбок данио индуцирует продукцию H ₂ O ₂ , которая, в свою очередь, привлекает нейтрофилы [1]. Мы показали, что H ₂ O ₂ увеличивает фосфорилирование ERK1 / 2, которое, как недавно было показано, важно в индуцированном H ₂ O ₂ хемотаксисе нейтрофилов [40]. Таким образом, кажется вероятным, что повторное нанесение хемоаттрактанта нейтрофилов на раны приведет к усилению воспаления.

Другой возможный механизм увеличения инфильтрации нейтрофилов — высвобождение молекул молекулярного паттерна, связанного с повреждением (DAMP).Поврежденные клетки могут высвобождать различные молекулы, такие как ядерный белок HMGB1 и митохондриальную ДНК, которые не только привлекают нейтрофилы, но и активируют их [41]. H ₂ O ₂ , как было показано, индуцирует высвобождение этих сигналов опасности макрофагами и моноцитами в моделях in vitro и [42].

Также возможно, что H ₂ O ₂ может увеличивать продукцию хемокинов, которые могут привлекать нейтрофилы. Мы исследовали эту возможность, измеряя CXCL1 (KC), CXCL5 (LIX), CCL2 (MCP-1) и CCL3 (MIP-1α) с помощью мультиплексного метода ELISA, но обнаружили, что при ранении сильно увеличивается продукция этих хемокинов, H ₂ O ₂ не изменяет профили секреции (Рисунок S5).Однако недостатком этого метода является невозможность определения биоактивности этих хемокинов. Интересно, что MMP-8 также, как было показано, расщепляет CXCL-8 и его мышиный гомолог CXCL5, и полученные фрагменты проявляют более сильные хемотатические свойства нейтрофилов [43]. Это может быть еще одним возможным механизмом повышенной инфильтрации нейтрофилов, которую мы наблюдали в ранах, обработанных H ₂ O ₂ .

Чрезмерная инфильтрация нейтрофилов может вызывать повреждение тканей, продуцируя ROS и различные протеазы.Поэтому было высказано предположение, что чрезмерная инфильтрация нейтрофилов может быть причиной плохого заживления ран [44]. Однако проблема кажется сложной. Например, было показано, что в ранах мышей с диабетом, лишенных лептина, наблюдается стойкая инфильтрация нейтрофилов. Системное введение лептина улучшает заживление и снижает инфильтрацию нейтрофилов, но не макрофагов, у этих мышей [45]. С другой стороны, местное применение GM-CSF улучшило закрытие ран и неоваскуляризацию у мышей с индуцированным стрептозоцином диабетом, моделью диабета I типа.Однако это улучшенное заживление также было связано с увеличением инфильтрации нейтрофилов и макрофагов [46]. Истощение нейтрофилов по разным показателям ускоряет [47] или задерживает заживление [48] различными группами. Возможно, эффекты устойчивой нейтрофильной инфильтрации различаются между разными моделями заживления ран.

Интересно, что хотя мы наблюдали повышенную инфильтрацию нейтрофилов, мы не наблюдали повышенного окислительного повреждения с точки зрения перекисного окисления липидов и нитрования белков.Это означает, что нейтрофилы, возможно, не производили чрезмерного количества ROS или повышение ROS было эффективно улучшено системой эндогенной антиоксидантной защиты. С другой стороны, мы наблюдали повышенный уровень ММП-8, который преимущественно продуцируется нейтрофилами [19].

Ранее мы продемонстрировали, что H ₂ O ₂ индуцирует стойкое фосфорилирование ERK1 / 2 и p38 в модели культуры клеток кератиноцитов [24]. Мы также показали, что стойкое фосфорилирование ERK1 / 2 необходимо для его пролиферативного действия.Однако мы обнаружили, что H ₂ O ₂ не индуцирует стойкое фосфорилирование ERK1 / 2 и p38 в наших in vivo ранах. По-видимому, экзогенно примененный H ₂ O ₂ оказывает различное действие на клетки в условиях in vivo, и , in vitro, .

Это первое исследование, насколько нам известно, в котором систематически отслеживаются изменения уровней окислительного повреждения в процессе заживления. Уровень перекисного окисления липидов был максимальным через 1 день после ранения, но снижался и стабилизировался на протяжении всего периода заживления.Было обнаружено, что изопростаны F ₂ являются отличными маркерами окислительного повреждения при заживлении ран. Их уровни были низкими, но обнаруживались на неповрежденной коже, но увеличивались в 9 раз через 1 день после ранения. Также было замечено, что уровни арахидоновой кислоты также увеличиваются по мере заживления раны. Это согласуется с сообщениями о более высоких уровнях арахидоновой кислоты наряду с другими полиненасыщенными жирными кислотами в гипертрофических рубцах по сравнению с нормальной кожей [49]. Эти изменения могут быть связаны с изменениями биосинтеза жирных кислот в кератиноцитах и ​​фибробластах в ответ на сигналы воспаления и пролиферации.Они также могут быть связаны с изменениями клеточного состава ран, поскольку воспалительные клетки инфильтрируют раны, и разные типы клеток могут быть по-разному чувствительны к H ₂ O ₂ [50]. Потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить причину изменения состава жирных кислот во время заживления ран.

Уровни нитратного повреждения были максимальными на 6-й день после ранения с увеличением в 2 раза. С другой стороны, нам не удалось обнаружить каких-либо изменений карбонила белка.Похоже, что изопростаны F ₂ являются более чувствительными и чувствительными биомаркерами окислительного повреждения, чем маркеры окисленных белков, поэтому мы рекомендуем использовать изопростаны F ₂ для использования в будущих исследованиях заживления ран.

В соответствии с предыдущими исследованиями мы обнаружили, что раны проявляют двухфазный ответ на местное нанесение H ₂ O ₂ , где более низкие его концентрации способствуют заживлению, а более высокие концентрации задерживают заживление.Однако задержка заживления не связана с усилением перекисного окисления липидов, окисления белков или нитратного стресса, как измерено с помощью F ₂ -изопростанов, карбонилов белков и 3-нитротирозинов.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

H ₂ O ₂ не влиял на уровни TIMP-1 в ранах. Ткани раны на 6 день лизировали и количество TIMP-1 измеряли с помощью вестерн-блоттинга. (A) Репрезентативный блот TIMP-1. (B) Денситометрический анализ обеих полос, нормализованных относительно α-тубулина.Показанные результаты представляют собой среднее значение ± S.E.M. (n = 4). Результаты были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа, и различия не были значительными. (р = 0,35)

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.s001

(TIF)

Рисунок S2.

166 мМ H ₂ O ₂ увеличивает инфильтрацию нейтрофилов, но 10 мМ H ₂ O ₂ нет. Представленные результаты являются средними ± S.E.M, n = 6–7. Показан репрезентативный раздел каждого лечения. ES — Эшар; HE — гиперпролиферирующий эпидермис; НД — neodermis.* р <0,05

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.s002

(TIF)

Рисунок S4.

Фосфорилирование ERK и p38 ослабляется на 4 часа. (A) Репрезентативные блоты лизата тканей раны, собранные через 30 мин после ранения. Кожа означает кожу нераненых животных, тогда как контроль означает раны, обработанные PBS. (B) Плотность фосфорилированных ERK и pan-ERK и (C) фосфорилированных p38 и pan p38 были нормализованы относительно α-тубулина. Показанные результаты представляют собой среднее значение ± S.Э.М. (n = 4). Результаты денситометрии были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа и не были статистически значимыми.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.s004

(TIF)

Рисунок S5.

Ранение увеличивает уровень хемокинов в ранах, но 166 мМ H ₂ O ₂ не увеличивает его. Ткани раны на 6-й день лизировали и анализировали с использованием метода матрицы суспензий на основе шариков. Кожа — это кожа, полученная от неповрежденных животных. (А) CXCL1 а.k.a. KC, (B) CXCL5, также известное как LIX, (C) CCL2, также известное как MCP-1 и (D) MIP-1α, сильно активировались после ранения, но не влияли на обработку 166 мМ h3O2. Показанные результаты представляют собой среднее кратное изменение ± S.E.M. п = 5

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049215.s005

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим профессоров Фан Тоан Тханг и Сит Ким Пинг за содержательные обсуждения и доктора Тан Сун Ю за его помощь на начальном этапе проекта.

Вклад авторов

Задумал и разработал эксперименты: AEKL YTW. Проведены эксперименты: AEKL YTW RH. Проанализированы данные: AEKL YTW RH. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: MW TD WTN. Написал статью: AEKL YTW BH.

Ссылки

1. 1. Niethammer P, Grabher C, Look AT, Mitchison TJ (2009) Градиент перекиси водорода в масштабе ткани обеспечивает быстрое обнаружение ран у рыбок данио. Nature 459: 996–999.
2. 2. Rieger S, Sagasti A (2011) Перекись водорода способствует вызванной травмой регенерации периферических сенсорных аксонов в коже рыбок данио.PLoS Biol 9: e1000621.
3. 3. Рой С., Ханна С., Наллу К., Хант Т.К., Сен С.К. (2006) Заживление кожных ран подлежит окислительно-восстановительному контролю. Мол Тер 13: 211–220.
4. 4. Охха Н., Рой С., Хе Дж., Бисвас С., Велаютам М. и др. (2008) Оценка окислительно-восстановительной среды в области раны и значение Rac2 в заживлении кожи. Free Radic Biol Med 44: 682–691.
5. 5. Schreml S, Landthaler M, Schaferling M, Babilas P (2011) Новая звезда на H (2) O (2) -зон заживления ран? Exp Dermatol 20: 229–231.
6. 6. Арул В., Масиламони Дж. Г., Джесудасон Е. П., Джаджи П. Дж., Инаятуллах М. и др .. (2011) Коллагеновые матрицы, содержащие глюкозооксидазу, для заживления кожных ран в моделях крыс с диабетом: биохимическое исследование. J Biomater Appl.
7. 7. Benhanifia MB, Boukraa L, Hammoudi SM, Sulaiman SA, Manivannan L (2011) Последние патенты на местное применение меда при лечении ран и ожогов. Недавние открытия Pat Inflamm Allergy Drug Discov 5: 81–86.
8. 8. Kwakman PH, Te Velde AA, de Boer L, Vandenbroucke-Grauls CM, Zaat SA (2011) Два основных лекарственных меда имеют разные механизмы бактерицидной активности.PLoS One 6: e17709.
9. 9. Шафер М., Вернер С. (2008) Окислительный стресс при нормальном и поврежденном заживлении ран. Pharmacol Res 58: 165–171.
10. 10. Yeoh-Ellerton S, Stacey MC (2003) Уровни железа и 8-изопростана в острых и хронических ранах. J Invest Dermatol 121: 918–925.
11. 11. Мозли Р., Хилтон Дж. Р., Уоддингтон Р. Дж., Хардинг К. Г., Стивенс П. и др. (2004) Сравнение профилей биомаркеров оксидативного стресса в условиях острой и хронической раны.Ремонт и регенерация ран 12: 419–429.
12. 12. Шукла А., Расик А.М., Патнаик Г.К. (1997) Истощение восстановленного глутатиона, аскорбиновой кислоты, витамина Е и ферментов антиоксидантной защиты в заживающей кожной ране. Free Radic Res 26: 93–101.
13. 13. Расик А.М., Шукла А. (2000) Антиоксидантный статус при отсроченном заживлении ран. Int J Exp Pathol 81: 257–263.
14. 14. Halliwell B, Gutteridge JMC (2007) Свободные радикалы в биологии и медицине. Оксфорд; Нью-Йорк: Издательство Оксфордского университета.851 с. п.
15. 15. Kmin A, Schafer M, Epp N, Bugnon P, Born-Berclaz C и др. (2007) Пероксиредоксин 6 необходим для целостности кровеносных сосудов в раненой коже. J Cell Biol 179: 747–760.
16. 16. Дженнер А., Рен М., Раджендран Р., Нинг П., Хуат Б.Т. и др. (2007) Добавка цинка ингибирует перекисное окисление липидов и развитие атеросклероза у кроликов, получавших диету с высоким содержанием холестерина. Free Radic Biol Med 42: 559–566.
17. 17. Lee CY, Huang SH, Jenner AM, Halliwell B (2008) Измерение F2-изопростанов, продуктов гидроксиэйкозатетраеновой кислоты и оксистеринов в одном образце плазмы.Free Radic Biol Med 44: 1314–1322.
18. 18. Goldner J (1938) Модификация техники трихрома Массона для рутинных лабораторных целей. Am J Pathol 14: 237–243.
19. 19. Hasty KA, Hibbs MS, Kang AH, Mainardi CL (1986) Секретированные формы нейтрофильной коллагеназы человека. J Biol Chem 261: 5645–5650.
20. 20. Hanemaaijer R, Sorsa T., Konttinen YT, Ding Y, Sutinen M, et al. (1997) Матриксная металлопротеиназа-8 экспрессируется в ревматоидных синовиальных фибробластах и ​​эндотелиальных клетках.Регулирование фактора некроза опухоли альфа и доксициклином. J Biol Chem 272: 31504–31509.
21. 21. Ван X, Юнг Дж., Асахи М., Чван В., Руссо Л. и др. (2000) Влияние нокаута гена матриксной металлопротеиназы-9 на морфологические и двигательные исходы после черепно-мозговой травмы. J Neurosci 20: 7037–7042.
22. 22. Kirk TZ, Mark ME, Chua CC, Chua BH, Mayes MD (1995) Миофибробласты из кожи склеродермии синтезируют повышенный уровень коллагена и тканевого ингибитора металлопротеиназы (TIMP-1) с двумя формами TIMP-1.J Biol Chem 270: 3423–3428.
23. 23. Agaiby AD, Dyson M (1999) Динамика иммуно-воспалительных клеток во время заживления кожных ран. J Anat 195 (Pt 4): 531–542.
24. 24. Loo AE, Ho R, Halliwell B (2011) Механизм миграции кератиноцитов, вызванной перекисью водорода, в модели царапины. Free Radic Biol Med 51: 884–892.
25. 25. Морроу Дж. Д., Хилл К. Э., Бурк Р. Ф., Наммор Т. М., Бадр К. Ф. и др. (1990) Ряд соединений, подобных простагландину F2, продуцируется in vivo у человека по нециклооксигеназному механизму, катализируемому свободными радикалами.Proc Natl Acad Sci U S A 87: 9383–9387.
26. 26. Halliwell B, Lee CY (2009) Использование изопростанов в качестве биомаркеров окислительного стресса: некоторые редко рассматриваемые вопросы. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал 13: 145–156.
27. 27. Судзуки Ю.Дж., Карини М., Баттерфилд Д.А. (2010) Карбонилирование белков. Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал 12: 323–325.
28. 28. Beckman JS, Koppenol WH (1996) Оксид азота, супероксид и пероксинитрит: хорошее, плохое и уродливое. Am J Physiol 271: C1424–1437.
29. 29. Беннетт Л.Л., Розенблюм Р.С., Перлов С., Дэвидсон Дж. М., Бартон Р. М. и др. (2001) Сравнение in vivo местных агентов для заживления ран. Пласт Реконстр Сург 108: 675–687.
30. 30. Лобманн Р., Амброш А., Шульц Г., Вальдманн К., Шивек С. и др. (2002) Экспрессия матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в ранах больных диабетом и недиабетиков. Диабетология 45: 1011–1016.
31. 31. Trengove NJ, Stacey MC, MacAuley S, Bennett N, Gibson J, et al.(1999) Анализ окружающей среды острой и хронической раны: роль протеаз и их ингибиторов. Регенерация восстановления ран 7: 442–452.
32. 32. Nwomeh BC, Liang HX, Cohen IK, Yager DR (1999) MMP-8 является преобладающей коллагеназой в заживляющих ранах и длительно незаживающих язвах. J Surg Res 81: 189–195.
33. 33. Миллер Э.Дж., Харрис ЭД-младший, Чанг Э., Финч Дж. Э.-мл., Маккроскери П.А. и др. (1976) Расщепление коллагенов типа II и III коллагеназой млекопитающих: сайт расщепления и первичная структура в Nh3-концевой части меньшего фрагмента, высвобождаемого из обоих коллагенов.Биохимия 15: 787–792.
34. 34. Murphy G, McAlpine CG, Poll CT, Reynolds JJ (1985) Очистка и характеристика костной металлопротеиназы, которая расщепляет желатин и коллаген типов IV и V. Biochim Biophys Acta 831: 49–58.
35. 35. Danielsen PL, Holst AV, Maltesen HR, Bassi MR, Holst PJ, et al. (2011) Сверхэкспрессия матричной металлопротеиназы-8 препятствует правильному восстановлению тканей. Хирургия 150: 897–906.
36. 36. Reiss MJ, Han YP, Garcia E, Goldberg M, Yu H и др.(2010) Матричная металлопротеиназа-9 задерживает заживление ран на мышиной модели ран. Хирургия 147: 295–302.
37. 37. Kyriakides TR, Wulsin D, Skokos EA, Fleckman P, Pirrone A, et al. (2009) У мышей, у которых отсутствует матричная металлопротеиназа-9, наблюдается замедленное заживление ран, связанное с отсроченной реэпителизацией и нарушенным фибриллогенезом коллагена. Матрица Биол 28: 65–73.
38. 38. Гутьеррес-Фернандес А., Инада М., Балбин М., Фуэйо А., Питиот А.С. и др. (2007) Усиленное воспаление замедляет заживление ран у мышей с дефицитом коллагеназы-2 (ММР-8).FASEB J 21: 2580–2591.
39. 39. Мерфи Г., Хубрехтс А., Кокетт М.И., Уильямсон Р.А., О’Ши М. и др. (1991) N-концевой домен тканевого ингибитора металлопротеиназ сохраняет активность ингибирования металлопротеиназ. Биохимия 30: 8097–8102.
40. 40. Yoo SK, Starnes TW, Deng Q, Huttenlocher A (2011) Lyn — это окислительно-восстановительный датчик, который опосредует привлечение лейкоцитов к ране in vivo. Природа 480: 109–112.
41. 41. Prince LR, Whyte MK, Sabroe I, Parker LC (2011) Роль TLR в активации нейтрофилов.Curr Opin Pharmacol 11: 397–403.
42. 42. Тан Д., Ши Й, Кан Р., Ли Т., Сяо В. и др. (2007) Перекись водорода стимулирует макрофаги и моноциты к активному высвобождению HMGB1. J Leukoc Biol 81: 741–747.
43. 43. Tester AM, Cox JH, Connor AR, Starr AE, Dean RA и др. (2007) Чувствительность к ЛПС и хемотаксис нейтрофилов in vivo требуют активности PMN MMP-8. PLoS One 2: e312.
44. 44. Брубакер А.Л., Шнайдер Д.Ф., Ковач Э.Дж. (2011) Нейтрофилы и естественные Т-клетки-киллеры как негативные регуляторы заживления ран.Эксперт Рев Дерматол 6: 5–8.
45. 45. Goren I, Kampfer H, Podda M, Pfeilschifter J, Frank S (2003) Лептин и воспаление ран у диабетических мышей ob / ob: дифференциальная регуляция притока нейтрофилов и макрофагов и потенциальная роль парши как приемника воспалительных клеток и медиаторов . Диабет 52: 2821–2832.
46. 46. Fang Y, Shen J, Yao M, Beagley KW, Hambly BD и др. (2009) Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ускоряет заживление ран при диабете за счет активации провоспалительных цитокинов.Br J Dermatol 162: 478–486.
47. 47. Дови JV, He LK, DiPietro LA (2003) Ускоренное закрытие ран у мышей с истощением нейтрофилов. J Leukoc Biol 73: 448–455.
48. 48. Nishio N, Okawa Y, Sakurai H, Isobe K (2008) Истощение нейтрофилов задерживает заживление ран у старых мышей. Возраст (Дордр) 30: 11–19.
49. 49. Номура Т., Тераши Х., Омори М., Сакураи А., Сунагава Т. и др. (2007) Липидный анализ нормальной дермы и гипертрофических рубцов. Восстановление заживления ран 15: 833–837.
50. 50. Loo AE, Halliwell B (2012) Эффекты перекиси водорода в модели совместного культивирования кератиноцитов и фибробластов при заживлении ран. Biochem Biophys Res Commun 423: 253–258.

Причины шрамов от прыщей и лучшие методы лечения рубцов от прыщей

Если вам когда-либо приходилось иметь дело со шрамами от прыщей — или если вы сейчас с ними боретесь — у вас, вероятно, возникнет много вопросов.Вот некоторые общие вопросы, связанные с рубцами от прыщей: Что вызывает рубцы от прыщей? Что вызывает у кого-то больше шрама? Что я могу сделать, чтобы предотвратить образование шрамов?

К счастью, у нас есть информация о том, что вызывает шрамы от прыщей, что увеличивает риск образования рубцов, и как лучше всего убрать эти неприятные шрамы подальше от вашего красивого лица. (Подсказка: не трогайте!)

Что вызывает шрамы от прыщей?

Когда на коже образуются прыщи, естественные процессы заживления в вашем теле начинают действовать так же, как при травме или болезни.Проблема в том, что это не всегда идеальная система. Прыщи образуются, когда поры кожи забиваются слишком большим количеством масла и омертвевшими клетками. Иногда он появляется близко к поверхности кожи — это означает, что он, вероятно, заживет через короткое время с минимальными рубцами. Однако, когда прыщи глубоко укоренились в коже, заживление занимает больше времени. Поскольку это проникает глубже и разрушает больше тканей кожи, часто остаются шрамы.

После высыпания ваше тело попытается исцелить себя, заменив потерянную ткань кожи, которая была разрушена.Рубцы возникают, когда организм производит слишком много или слишком мало этой ткани. Когда в организме образуется слишком много ткани, прыщи превращаются в приподнятый рубец, известный как гипертрофический рубец (или, в тяжелых случаях, келоид). С другой стороны, недостаток ткани приводит к появлению кожных углублений, известных как атрофические рубцы.

Темные отметины, которые иногда появляются после сильной вспышки, представляют собой шрам другого типа. Технически это вовсе не шрамы, а просто изменения пигментации (технический термин, обозначающий цвет кожи).Когда поражение появляется или раскрывается каким-либо другим способом, кожа должна снова смыкаться и скрывать углубление. Ваше тело, как правило, неплохо само излечивается, но после особенно глубокой травмы — например, ямки от лопнувшей прыщи — тело не всегда покрывается незаметно. Часто кожа, закрывающая рану, меняет цвет, текстуру или тон. В других случаях сломанные кровеносные сосуды из лопнувшего поражения оставляют след на вашей коже. Это то, что мы обычно называем «темными пятнами» или гиперпигментацией.

Даже если вы не избавитесь от прыщей, вы все равно можете увидеть на коже темно-красные или коричневые пятна от особенно глубоких или воспаленных участков. Однако не паникуйте: если вы воздерживались от появления прыща, эти пятна обычно исчезают в течение нескольких месяцев.

Каковы лучшие методы лечения прыщей?

Рассмотрение множества доступных способов лечения акне может быть утомительным и утомительным. Наша команда лицензированных специалистов по уходу за кожей помогает пациентам лечить как активные вспышки акне, так и рубцы, которые могут возникнуть в результате поражений.Узнайте больше о различных доступных методах лечения.

Что можно сделать, чтобы предотвратить появление шрамов от прыщей?

Выдавливание прыщей — самый верный способ образования шрама. На самом деле, когда дело доходит до прыщей, «руки прочь» — определенно лучший способ. Прикосновение, тыкание или покалывание в области поражения добавляет к коже больше масла и вызывает более глубокую травму — и то, и другое увеличивает риск образования рубцов.

Конечно, это легче сказать, чем сделать. И поверьте нам, мы знаем, как трудно удержаться от прыщей.Даже если вы знаете, что это вредно для вашей кожи в долгосрочной перспективе, иногда вам просто хочется сразу избавиться от этого. Прежде чем протянуть руку и быстро избавиться от этого угря, помните, что, хотя это может решить краткосрочную проблему, оно только вызовет у вас горе позже. Так что делайте все возможное, чтобы не избавить себя от страданий этого прыща.

Почему у меня появляются шрамы от прыщей?

К сожалению, даже если вы практикуете политику невмешательства, у вас все равно могут появиться шрамы.Вот несколько факторов, которые влияют на то, разовьются ли у вас устойчивые отметки после сильного прорыва:

• Фактор 1: Генетика: У некоторых людей рубцы просто заложены в генах. Если в вашей семье были шрамы от угревой сыпи, вы можете проявлять особую осторожность при уходе за своей кожей.

• Фактор 2: Воздействие солнца: Витамин D на солнечном свете отлично подходит для вашего лица — только не ешьте его слишком много. Хотя интенсивное пребывание на солнце не может напрямую вызывать рубцы, оно определенно играет роль в том, чтобы ваши пятна от прыщей стали темнее и заметнее.

• Фактор 3: Половое созревание: Большой сюрприз, правда? Когда-нибудь мы обнаружим, что половое созревание действительно для чего-то полезно. Между тем, похоже, это доставит больше проблем, чем того стоит. Показательный пример: у подростков чаще появляются прыщи из-за всех гормональных изменений, происходящих в их организме. А чем больше прыщей, тем выше риск образования рубцов.

• Фактор 4: Степень тяжести акне: Как и следовало ожидать, рубцевание напрямую связано с серьезностью.Когда прыщи более воспалены, более широко распространены и глубоко укоренились в коже, вероятность образования рубцов возрастает.

• Фактор 5: Частота появления угрей: Точно так же пациенты, у которых возникают частые высыпания, имеют более высокий риск образования рубцов.

• Фактор 6: Пол: И у мужчин, и у женщин могут появиться рубцы от угревой сыпи — это просто кажется более заметным среди мужчин. Это потому, что, как правило, у мужчин более серьезные и стойкие угри возникают из-за андрогена (мужского гормона).Извините ребята.

• Фактор 7: Время: Чем раньше, тем лучше! Оказывается, чем дольше вы ждете перед лечением, тем выше риск образования рубцов. Так что если просто умыть лицо и держать руки подальше от цели не получается, возможно, пришло время обратиться к дерматологу за помощью.

Лекарство-антикоагулянт варфарин

Что такое варфарин?

Варфарин натрия — антикоагулянтный препарат.«Анти» означает против, а «коагулянт» означает вызывающий свертывание крови . Варфарин контролирует сгусток крови (уплотнение) внутри кровеносных сосудов. Торговые марки варфарина — Coumadin® и Jantoven®.

Что делают антикоагулянты, такие как варфарин?

Антикоагулянт помогает вашему организму контролировать скорость свертывания крови, что помогает предотвратить образование нежелательных сгустков внутри ваших артерий, вен или сердца при определенных заболеваниях и во время длительного отсутствия физической активности.

Если у вас есть тромб, антикоагулянт может препятствовать его увеличению. Это также может предотвратить отрыв части сгустка и его попадание в легкие, мозг или сердце. Антикоагулянт также помогает предотвратить образование новых сгустков.

Антикоагулянт , а не растворяет сгусток крови. Однако со временем сгусток может рассосаться сам по себе.

Как мне принимать варфарин?

Вы будете принимать варфарин каждый день. Доза обычно составляет от 1 мг до 10 мг.Ваш лечащий врач назначит вам конкретную дозировку, однако имейте в виду, что эта дозировка может измениться в зависимости от результатов каждого лабораторного теста.

Другие инструкции по приему варфарина включают:

• Принимайте дозу варфарина один раз в день в соответствии с инструкциями.
• Принимайте дозу каждый день в одно и то же время. Мы рекомендуем 17:00.
• Варфарин можно принимать до или после еды.
• Если вы забыли принять дозу и в течение восьми часов вспомните времени, когда вы должны были принять дозу, примите дозу.Если прошло больше восьми часов, подождите до следующего дня и примите только дозы, предписанной для этого дня. НЕ ПРИНИМАЙТЕ ДВОЙНОЙ ДОЗЫ.
• Если вы забыли принять варфарин два или более дней подряд, позвоните своему врачу. Возможно, потребуется изменить дозу. (Никогда не меняйте дозу самостоятельно, не позвонив сначала своему врачу.)
• Подумайте об использовании таблеток, чтобы не забыть о приеме лекарств, или возьмите календарь и отметьте каждый день после приема дозы.
• Повторяйте рецепт за неделю до того, как закончится ваш запас, чтобы не пропустить дозу.
• Продолжайте принимать варфарин, пока его прописал врач. Никогда не прекращайте принимать варфарин самостоятельно, не обсудив это с вашим врачом.

Внешний вид планшета

Варфарин производится несколькими производителями лекарств и доступен в виде таблеток различных форм, размеров и цветов. Каждый цвет таблетки представляет собой разную концентрацию, измеряемую в миллиграммах (мг).Все производители используют один и тот же цветовой код для разной силы своих таблеток, однако размер и форма таблеток могут отличаться от одного производителя к другому.

На каждой таблетке нанесено обозначение прочности на одной стороне и нанесена отметка (имеется выемка на таблетке), поэтому ее можно легко сломать пополам, если ваше здоровье Поставщик корректирует дозу. Например: если ваш врач прописывает таблетку 5 мг, а затем изменяет дозу на 2,5 мг (2½ мг), что вдвое меньше, вам следует сломать одну из таблеток 5 мг пополам и принять половину таблетки. Если у вас есть какие-либо вопросы о дозе варфарина, обратитесь к своему провайдеру.

Какие анализы крови мне понадобятся, пока я принимаю варфарин?

Вам нужно будет сдать кровь на анализ, чтобы определить, насколько эффективно лекарство. Анализ крови, называемый протромбиновым временем (PT или protime), используется для расчета вашего международного нормализованного отношения (INR). Ваш INR помогает вашему лечащему врачу определить, насколько эффективно варфарин предотвращает образование тромбов и нужно ли корректировать дозу.

Анализы крови делают в лаборатории или клинике антикоагуляции, в медицинском кабинете или дома.Анализы крови обычно проводятся от одного или нескольких раз в неделю до одного раза в месяц (если ваши результаты стабильны). Следуйте инструкциям врача, чтобы узнать, как часто вам нужно сдавать анализы крови и когда корректировать суточную дозу варфарина.

Другая информация о ваших анализах крови:

• Болезнь, состояние здоровья, изменения в диете или приеме лекарств могут повлиять на ваше МНО. Сообщите своему врачу об изменениях в вашем здоровье, лекарствах (рецептурных и внебиржевых) или образе жизни, чтобы можно было внести соответствующие корректировки в дозировку.
• Если вы планируете поездку, поговорите со своим поставщиком медицинских услуг об использовании другой лаборатории для анализа крови во время путешествия.

Где хранить варфарин?

Храните варфарин при комнатной температуре, вдали от сильного холода, тепла, света и влаги. Никогда не храните лекарства в шкафчиках для ванной из-за влажности в ванных комнатах.

Всегда храните лекарства в недоступном для детей и домашних животных месте.

Какие меры предосторожности следует соблюдать при приеме варфарина?

При приеме варфарина важно соблюдать эти меры предосторожности.

Беременность

Важно избегать беременности во время приема варфарина. Используйте надежные методы контроля рождаемости, чтобы предотвратить беременность, если вы женщина и еще не достигли менопаузы.

Если вы принимаете варфарин и планируете забеременеть, поговорите со своим врачом о возможных рисках и способах снижения этих рисков. Немедленно сообщите своему врачу, если вы забеременели или подозреваете, что беременны. .

Хирургия и стоматология

Перед лечением сообщите всем врачам и стоматологам, что вы принимаете варфарин.Возможно, вам придется сдать анализ крови и прекратить прием варфарина за несколько дней до операции или стоматологической процедуры.

Обязательно свяжитесь с вашим лечащим врачом, который контролирует ваш варфарин, по крайней мере, за две недели до любой стоматологической или хирургической процедуры, если это возможно. Не прекращайте прием варфарина, не посоветовавшись предварительно со своим врачом.

Упражнение

Проконсультируйтесь с вашим врачом перед началом любых упражнений или спортивной программы. Поговорите со своим врачом, если вы планируете какие-либо серьезные изменения в диете, такие как диета для снижения веса, или если вы планируете добавить какие-либо пищевые добавки.

Диета

Продукты питания и витамин К. Витамин К необходим для нормального свертывания крови. Однако большие изменения количества витамина К в вашем рационе могут изменить принцип действия варфарина. Если вы едите продукты с высоким содержанием витамина К, важно поддерживать постоянное еженедельное потребление продуктов, содержащих витамин К.

Сообщите своему врачу, если вы думаете об изменении своих нынешних привычек питания. Сообщите своему провайдеру, если вы планируете:

• Ешьте больше или меньше овощей.
• Перейдите на вегетарианский стиль питания.
• Следуйте особому плану питания, чтобы похудеть или набрать вес.

Изменение ваших привычек в еде может означать, что вы будете получать больше или меньше витамина К с продуктами, которые вы едите. Если вы измените свои привычки в еде, ваш врач может захотеть чаще проверять вашу кровь, чтобы узнать, как действует варфарин.

Известно, что перечисленные ниже овощи содержат большое количество витамина К на порцию. Хотя важно знать о продуктах с высоким содержанием витамина К, также важно придерживаться сбалансированной диеты.

Если вы хотите, чтобы в ежедневной порции овощей было больше овощи с низким содержанием витамина К, такие как кукуруза, кабачки, картофель, лук, морковь, огурцы, сельдерей, перец, тыква и помидоры.

Травяные чаи. Не начинайте употреблять следующие травяные чаи и добавки, потому что они могут повлиять на МНО, сделав его слишком высоким или слишком низким. Если вы пьете чай, подойдет черный чай (например, апельсиновый чай пекое), потому что он не богат витамином К.

Травяные добавки. Следующие ниже травяные добавки могут влиять на INR, делая его слишком высоким или слишком низким. Определенные продукты, такие как сельдерей, гвоздика, чеснок, имбирь и петрушка, обычно безопасны, если они используются в небольших количествах в кулинарии или в качестве приправы (они отмечены звездочкой [*]). Их не следует использовать в форме дополнение.

5348

5348

Другие советы по питанию:

• Избегайте продуктов из грейпфрута, граната и клюквы.
• Ешьте все остальные продукты как обычно.
• Следующие травяные добавки могут препятствовать свертыванию крови, и их не следует использовать при приеме антикоагулянтов перед операцией:
  • Чеснок.
  • Имбирь.
  • Gingko biloba.
  • Женьшень.
  • Пиретрум.
  • Рыбий жир.
  • Куркума.
  • Зверобой.
  • Хондроитинсульфат.
• Не принимайте витаминные добавки, которые обеспечивают более 100 процентов Рекомендуемой суточной нормы (RDA). Сообщите своему врачу, если вы в настоящее время принимаете больше, чем рекомендованная суточная норма любых витаминов (особенно витаминов A, C или E).
• Пищевые добавки, включая Boost® и Ensure®, также могут влиять на уровень варфарина. Спросите своего лечащего врача о целесообразности приема этих продуктов.
• Алкоголь увеличивает риск сильного кровотечения. Спросите у своего врача, безопасно ли вам употреблять алкогольные напитки во время приема варфарина.

Лекарства

Некоторые лекарства могут усиливать антикоагулянтный эффект варфарина; другие могут уменьшить эффект. Вам может потребоваться чаще сдавать анализы крови, когда вы прекращаете, начинаете или увеличиваете дозу лекарств, которые могут повлиять на действие варфарина. Возможно, потребуется скорректировать и дозировку варфарина.Поговорите со своим лечащим врачом, который принимает варфарин, если у вас есть какие-либо изменения в других лекарствах, отпускаемых по рецепту.

Это НЕ полный список лекарств, которые могут повлиять на действие варфарина. Фактически, многие лекарства, отпускаемые без рецепта, также могут повлиять на действие варфарина. Некоторые примеры включают ацетаминофен (Тайленол®), аспирин, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) (такие как ибупрофен, напроксен или кетопрофен, а также лекарства от простуды и кашля, содержащие НПВП), антациды, слабительные или другие лекарства от боли или дискомфорта.

Всегда уточняйте у поставщика медицинских услуг, который следит за приемом варфарина, ПРЕЖДЕ, чем принимать какие-либо безрецептурные лекарства, растительные продукты, натуральные лечебные средства, пищевые добавки или лекарства, отпускаемые по рецепту другого поставщика медицинских услуг или стоматолога.Вашему врачу может потребоваться скорректировать дозу варфарина или он может порекомендовать другое лекарство или продукт, который с меньшей вероятностью помешает варфарину. Не прекращайте и не начинайте прием лекарств, не посоветовавшись предварительно со своим лечащим врачом. .

Ежедневная деятельность

• Будьте осторожны при использовании бритвы. Используйте электрическую бритву или кремы для удаления волос, чтобы уменьшить вероятность порезов.
• Используйте мягкую зубную щетку. Осторожно почистите щеткой и нитью, чтобы предотвратить кровотечение из десен.

Заболевания и неотложные состояния

• Держите при себе номер телефона поставщика медицинских услуг на случай чрезвычайной ситуации.
• Позвоните своему врачу, если у вас есть какие-либо симптомы болезни, такие как рвота, диарея, инфекция или жар. Болезнь может изменить действие варфарина.
• Всегда имейте при себе или носите удостоверение личности с указанием, что вы принимаете варфарин. В экстренной ситуации вы не сможете говорить за себя.
• Избегайте ситуаций дома или на работе, которые могут привести к травмам.Необходимо следить за кровотечением даже при незначительных травмах, поскольку варфарин влияет на свертываемость крови. Падения, вызывающие синяки (кровотечение под кожей) и порезы острыми предметами, более серьезны, если вы принимаете варфарин. Позвоните своему врачу, если вы получили травмы в результате падений или ударов по телу или голове.

Путешествие

• Проконсультируйтесь с врачом перед поездкой. Перед отъездом вам может потребоваться сдать анализ крови и скорректировать дозу варфарина.
• Во время путешествия всегда носите с собой лекарства.Не кладите лекарства в зарегистрированный багаж и не оставляйте их в машине.
• Если во время путешествия длительное время вы сидите, вставайте и ходите, если это возможно, или поднимайте ступни и ноги.

Что мне делать, если я порезался во время приема варфарина?

Если вы порезались и порез небольшой, постоянно давите на порез, пока кровотечение не остановится. Это может занять до 10 минут. Если кровотечение не прекращается, продолжайте оказывать давление и обратитесь в ближайшее отделение неотложной помощи.

Если вы порезались и порез большой, прилагайте постоянное давление и немедленно обратитесь за помощью, позвонив по номеру 911 или по местному номеру службы экстренной помощи, или попросив кого-нибудь отвезти вас в ближайшее отделение неотложной помощи.

Каковы побочные эффекты варфарина?

Кровотечение является наиболее частым побочным эффектом варфарина и может проявляться в виде любого из нескольких различных симптомов. Позвоните своему врачу, если заметите любой из следующих признаков кровотечения :

• Чувство холода, слабости или усталости, чем обычно, или бледность (симптомы анемии).
• Кровотечение из порезов, которое не прекращается после приложения давления в течение 10 минут.
• Кровотечение из носа, десен или ушей, которое не прекращается через 10 минут.
• Повышенная температура или усиливающееся заболевание.
• Менструальное кровотечение (период) обильнее или длится дольше обычного.
• Моча красноватого или ржавого цвета.
• Испражнения, которые выглядят ярко-красными, черными или дегтеобразными.
• Синяки, которые появляются без причины или становятся опухшими или болезненными; багровые пятна на коже.
• Кашляет кровью.
• Рвота кровью (может выглядеть как кофейная гуща).
• Необычное кровотечение при геморрое.
• Необычная боль или припухлость, особенно в суставах.
• Необычная головная боль.
• Боль в животе или животе.
• Внезапные изменения речи или зрения.
• Онемение / покалывание на одной стороне лица или в руке.
• Головокружение.
• Затрудненное дыхание.

Если у вас есть какие-либо из этих симптомов, ваш врач может захотеть сделать анализ крови, изменить дозу, прекратить прием лекарства или дать вам лекарство, чтобы остановить кровотечение.

Краткое изложение важных моментов, которые следует запомнить

• Принимайте варфарин в соответствии с инструкциями каждый день в одно и то же время.
• Сдайте кровь на анализ в соответствии с инструкциями, чтобы проверить ее свертываемость.
• Обсудите все лекарства, которые вы принимаете, даже лекарства, отпускаемые без рецепта, со своим врачом и фармацевтом, поскольку многие лекарства могут взаимодействовать с варфарином.
• Не НЕ прекращать или начинать принимать какие-либо лекарства, растительные продукты, натуральные средства или пищевые добавки, не посоветовавшись предварительно с поставщиком, который контролирует прием варфарина.
• Сообщите любому, кто оказывает медицинскую или стоматологическую помощь, что вы принимаете варфарин.
• Ешьте примерно одинаковое количество продуктов, содержащих витамин К, каждую неделю, поскольку эти продукты могут повлиять на действие варфарина.
• Если вы забыли принять таблетку, НЕ принимайте двойную дозу. Примите пропущенную дозу как можно скорее в тот же день. НЕ принимать двойную дозу варфарина на следующий день, чтобы восполнить пропущенную дозу.
• Следите за признаками аномального или чрезмерного кровотечения и синяков.Немедленно позвоните своему врачу, если подозреваете, что что-то не так.
• ЗАПРЕЩАЕТСЯ менять препараты варфарина без предварительной консультации с врачом. Продукты варфарина разных марок могут НЕ быть идентичными, и вам может потребоваться более частая проверка и корректировка дозы, если вы измените марку.
• НЕ ПРЕКРАЩАЙТЕ варфарин даже для незначительных процедур, таких как стоматологическая работа, без предварительной консультации с врачом, наблюдающим за вашей терапией.